本文選題：UCH-L3　切入點(diǎn)：Ub　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:泛素蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome system,UPS)是存在于真核生物中的除自噬系統(tǒng)以外的另一種非常重要的蛋白質(zhì)降解方式,它在各種細(xì)胞功能和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中均發(fā)揮著十分重要的作用。去泛素羧基末端水解酶(UCH,Ubiquitin carboxyterminal hydrolases)和泛素(Ub)分別是UPS家族中的一員,越來(lái)越多的研究證實(shí),UCH和Ub與許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展均有著十分緊密的聯(lián)系。自噬是普遍存在于真核細(xì)胞中的一條降解胞內(nèi)蛋白質(zhì)的主要途徑,它主要對(duì)存在于體內(nèi)的一些細(xì)胞器和長(zhǎng)壽命蛋白進(jìn)行降解。有研究表明自噬系統(tǒng)和泛素蛋白酶體系統(tǒng)之間存在著緊密的聯(lián)系。SQSTM1/P62(sequestosome 1)可以通過(guò)巨自噬和蛋白酶體選擇性的降解多聚泛素化的蛋白質(zhì)。本研究的主要目的:第一:我們首先通過(guò)檢測(cè)自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素、自噬抑制劑3-MA分別處理HL-60細(xì)胞前后的變化探討自噬系統(tǒng)對(duì)泛素蛋白酶體系統(tǒng)以及P62的影響。第二:通過(guò)觀察蛋白酶體抑制劑硼替佐米處理HL-60細(xì)胞前后的差異探討泛素蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)自噬及P62的影響。第三:硼替佐米與雷帕霉素聯(lián)合應(yīng)用后觀察泛素蛋白酶體系統(tǒng)與自噬之間的相互作用以及對(duì)P62的影響。第四:檢測(cè)急性髓白血病初發(fā)患者外周血中LC3Ⅱ、UCH-L3、P62三者mRNA的表達(dá)變化,進(jìn)一步探討急性髓白血病與自噬和泛素蛋白酶體以及P62之間的關(guān)系。希望能夠?yàn)榘籽〉谋O(jiān)測(cè)與治療提供一個(gè)新的方向。方法:1.自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-MA分別處理HL-60細(xì)胞后,CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況,透射電鏡下觀察自噬小體的形成情況,RT-PCR檢測(cè)LC3Ⅱ、UCH-L3、P62三者mRNA水平的表達(dá)變化,Western-blot檢測(cè)LC3Ⅱ、UCH-L3、Ub、P62四者蛋白水平的表達(dá)變化。2.泛素蛋白體抑制劑硼替佐米處理hl-60細(xì)胞后,cck8法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況,透射電鏡下觀察自噬小體的形成情況,rt-pcr檢測(cè)lc3Ⅱ、uch-l3、p62三者mrna水平的表達(dá)變化,western-blot檢測(cè)lc3Ⅱ、uch-l3、ub、p62四者蛋白水平的表達(dá)變化。3.泛素蛋白酶體抑制劑硼替佐米與自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素聯(lián)合應(yīng)用處理hl-60細(xì)胞后,透射電鏡下觀察自噬小體的形成情況,rt-pcr檢測(cè)lc3Ⅱ、uch-l3、p62三者mrna水平的表達(dá)變化,western-blot檢測(cè)lc3Ⅱ、uch-l3、ub、p62四者蛋白水平的表達(dá)變化。4.提取急性髓白血病初發(fā)患者外周血的單個(gè)核細(xì)胞,rt-pcr檢測(cè)與健康對(duì)照組相比lc3ii、uch-l3、p62三者mrna水平的表達(dá)變化。結(jié)果:1.自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-ma對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性;隨著時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡比例有所提高;雷帕霉素處理組電鏡下觀察到有自噬小體的形成;雷帕霉素分別處理hl-60細(xì)胞后,rt-pcr檢測(cè)lc3Ⅱ、uch-l3二者mrna的表達(dá)均上調(diào),p62mrna的表達(dá)下調(diào),western-blot檢測(cè)lc3Ⅱ、uch-l3、ub三者蛋白的表達(dá)均上調(diào),p62蛋白的表達(dá)下調(diào);3-ma處理hl-60細(xì)胞后,rt-pcr檢測(cè)lc3ii、uch-l3二者的mrna表達(dá)均下調(diào),p62mrna的表達(dá)上調(diào),western-blot檢測(cè)lc3Ⅱ、uch-l3、ub三者的蛋白表達(dá)均下調(diào),p62蛋白的表達(dá)上調(diào);以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2.泛素蛋白酶體抑制劑硼替佐米對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性,且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡比例有所提高;電鏡下觀察到大量自噬小體的形成;硼替佐米處理hl-60細(xì)胞后,rt-pcr檢測(cè)lc3Ⅱ、p62二者的mrna表達(dá)均上調(diào),uch-l3mrna表達(dá)下調(diào);western-blot檢測(cè)lc3Ⅱ、p62二者的蛋白表達(dá)均上調(diào),uch-l3、ub二者的蛋白表達(dá)均下調(diào);以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3.硼替佐米+雷帕霉素共同處理hl-60細(xì)胞后,電鏡下觀察到有自噬小體的形成,rt-pcr檢測(cè)lc3Ⅱ、p62二者的mrna表達(dá)均上調(diào),uch-l3mrna表達(dá)下調(diào);western-blot檢測(cè)lc3Ⅱ、p62二者的蛋白表達(dá)均上調(diào),uch-l3、ub二者的蛋白表達(dá)均下調(diào)。硼替佐米+3-ma處理hl-60后,電鏡下觀察到有自噬小體的形成,但數(shù)量少于硼替佐米+雷帕霉素共同處理組,以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.外周血基因水平檢測(cè)結(jié)果顯示,急性髓白血病初發(fā)患者與健康對(duì)照組相比較LC3II mRNA的表達(dá)上調(diào),UCH-L3 mRNA的表達(dá)下調(diào),P62 m RNA的表達(dá)上調(diào),以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.雷帕霉素誘導(dǎo)急性髓白血病細(xì)胞HL-60自噬后,UCH-L3、P62、Ub在基因與蛋白水平與對(duì)照組相比均發(fā)生了明顯的變化,而自噬抑制劑3-MA卻從基因和蛋白水平抑制了這種表達(dá)變化,因此表明泛素蛋白酶體系統(tǒng)與P62二者可能參與雷帕霉素誘導(dǎo)的急性髓白血病細(xì)胞的自噬發(fā)生過(guò)程。2.泛素蛋白酶體抑制劑硼替佐米作用于HL-60細(xì)胞后細(xì)胞自噬水平升高,提示抑制泛素蛋白酶體系統(tǒng)可能促進(jìn)自噬的發(fā)生。3.硼替佐米與雷帕霉素共同處理HL-60后細(xì)胞自噬水平較雷帕霉素單獨(dú)處理時(shí)升高,說(shuō)明自噬系統(tǒng)與泛素蛋白酶體系統(tǒng)之間存在著協(xié)同作用。4.急性髓白血病初發(fā)患者外周血中LC3II、UCH-L3、P62的表達(dá)變化說(shuō)明急性髓細(xì)胞白血病的發(fā)生可能是自噬、泛素蛋白酶體系統(tǒng)及P62共同協(xié)調(diào)作用的結(jié)果。
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【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R733.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 李婉麗;楊惠軍;張本山;黃彥勤;鄒愛(ài)軍;蔣小梅;楊海霞;吳攀;鄭敏翠;宋國(guó)才;;自噬基因Beclin-1在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的表達(dá)[J];中國(guó)誤診學(xué)雜志;2011年16期

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本文編號(hào)：1590405