發(fā)布時間：2018-03-09 21:55

  本文選題：UCH-L3　切入點：Ub　出處：《大連醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:泛素蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome system,UPS)是存在于真核生物中的除自噬系統(tǒng)以外的另一種非常重要的蛋白質降解方式,它在各種細胞功能和體內穩(wěn)態(tài)中均發(fā)揮著十分重要的作用。去泛素羧基末端水解酶(UCH,Ubiquitin carboxyterminal hydrolases)和泛素(Ub)分別是UPS家族中的一員,越來越多的研究證實,UCH和Ub與許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展均有著十分緊密的聯系。自噬是普遍存在于真核細胞中的一條降解胞內蛋白質的主要途徑,它主要對存在于體內的一些細胞器和長壽命蛋白進行降解。有研究表明自噬系統(tǒng)和泛素蛋白酶體系統(tǒng)之間存在著緊密的聯系。SQSTM1/P62(sequestosome 1)可以通過巨自噬和蛋白酶體選擇性的降解多聚泛素化的蛋白質。本研究的主要目的:第一:我們首先通過檢測自噬誘導劑雷帕霉素、自噬抑制劑3-MA分別處理HL-60細胞前后的變化探討自噬系統(tǒng)對泛素蛋白酶體系統(tǒng)以及P62的影響。第二:通過觀察蛋白酶體抑制劑硼替佐米處理HL-60細胞前后的差異探討泛素蛋白酶體系統(tǒng)對自噬及P62的影響。第三:硼替佐米與雷帕霉素聯合應用后觀察泛素蛋白酶體系統(tǒng)與自噬之間的相互作用以及對P62的影響。第四:檢測急性髓白血病初發(fā)患者外周血中LC3Ⅱ、UCH-L3、P62三者mRNA的表達變化,進一步探討急性髓白血病與自噬和泛素蛋白酶體以及P62之間的關系。希望能夠為白血病的監(jiān)測與治療提供一個新的方向。方法:1.自噬誘導劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-MA分別處理HL-60細胞后,CCK8法檢測細胞的生長增殖情況,流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況,透射電鏡下觀察自噬小體的形成情況,RT-PCR檢測LC3Ⅱ、UCH-L3、P62三者mRNA水平的表達變化,Western-blot檢測LC3Ⅱ、UCH-L3、Ub、P62四者蛋白水平的表達變化。2.泛素蛋白體抑制劑硼替佐米處理hl-60細胞后,cck8法檢測細胞的生長增殖情況,流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況,透射電鏡下觀察自噬小體的形成情況,rt-pcr檢測lc3Ⅱ、uch-l3、p62三者mrna水平的表達變化,western-blot檢測lc3Ⅱ、uch-l3、ub、p62四者蛋白水平的表達變化。3.泛素蛋白酶體抑制劑硼替佐米與自噬誘導劑雷帕霉素聯合應用處理hl-60細胞后,透射電鏡下觀察自噬小體的形成情況,rt-pcr檢測lc3Ⅱ、uch-l3、p62三者mrna水平的表達變化,western-blot檢測lc3Ⅱ、uch-l3、ub、p62四者蛋白水平的表達變化。4.提取急性髓白血病初發(fā)患者外周血的單個核細胞,rt-pcr檢測與健康對照組相比lc3ii、uch-l3、p62三者mrna水平的表達變化。結果:1.自噬誘導劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-ma對細胞的生長抑制率均具有時間和濃度依賴性;隨著時間的延長細胞凋亡比例有所提高;雷帕霉素處理組電鏡下觀察到有自噬小體的形成;雷帕霉素分別處理hl-60細胞后,rt-pcr檢測lc3Ⅱ、uch-l3二者mrna的表達均上調,p62mrna的表達下調,western-blot檢測lc3Ⅱ、uch-l3、ub三者蛋白的表達均上調,p62蛋白的表達下調;3-ma處理hl-60細胞后,rt-pcr檢測lc3ii、uch-l3二者的mrna表達均下調,p62mrna的表達上調,western-blot檢測lc3Ⅱ、uch-l3、ub三者的蛋白表達均下調,p62蛋白的表達上調;以上差異均具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。2.泛素蛋白酶體抑制劑硼替佐米對細胞的生長抑制率具有時間和濃度依賴性,且隨著時間的延長細胞凋亡比例有所提高;電鏡下觀察到大量自噬小體的形成;硼替佐米處理hl-60細胞后,rt-pcr檢測lc3Ⅱ、p62二者的mrna表達均上調,uch-l3mrna表達下調;western-blot檢測lc3Ⅱ、p62二者的蛋白表達均上調,uch-l3、ub二者的蛋白表達均下調;以上差異均具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。3.硼替佐米+雷帕霉素共同處理hl-60細胞后,電鏡下觀察到有自噬小體的形成,rt-pcr檢測lc3Ⅱ、p62二者的mrna表達均上調,uch-l3mrna表達下調;western-blot檢測lc3Ⅱ、p62二者的蛋白表達均上調,uch-l3、ub二者的蛋白表達均下調。硼替佐米+3-ma處理hl-60后,電鏡下觀察到有自噬小體的形成,但數量少于硼替佐米+雷帕霉素共同處理組,以上差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.外周血基因水平檢測結果顯示,急性髓白血病初發(fā)患者與健康對照組相比較LC3II mRNA的表達上調,UCH-L3 mRNA的表達下調,P62 m RNA的表達上調,以上差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1.雷帕霉素誘導急性髓白血病細胞HL-60自噬后,UCH-L3、P62、Ub在基因與蛋白水平與對照組相比均發(fā)生了明顯的變化,而自噬抑制劑3-MA卻從基因和蛋白水平抑制了這種表達變化,因此表明泛素蛋白酶體系統(tǒng)與P62二者可能參與雷帕霉素誘導的急性髓白血病細胞的自噬發(fā)生過程。2.泛素蛋白酶體抑制劑硼替佐米作用于HL-60細胞后細胞自噬水平升高,提示抑制泛素蛋白酶體系統(tǒng)可能促進自噬的發(fā)生。3.硼替佐米與雷帕霉素共同處理HL-60后細胞自噬水平較雷帕霉素單獨處理時升高,說明自噬系統(tǒng)與泛素蛋白酶體系統(tǒng)之間存在著協(xié)同作用。4.急性髓白血病初發(fā)患者外周血中LC3II、UCH-L3、P62的表達變化說明急性髓細胞白血病的發(fā)生可能是自噬、泛素蛋白酶體系統(tǒng)及P62共同協(xié)調作用的結果。
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【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R733.7

【參考文獻】

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1 李婉麗;楊惠軍;張本山;黃彥勤;鄒愛軍;蔣小梅;楊海霞;吳攀;鄭敏翠;宋國才;;自噬基因Beclin-1在兒童急性淋巴細胞白血病細胞的表達[J];中國誤診學雜志;2011年16期

2 鄭杰;;mTOR信號途徑與腫瘤[J];生命科學;2006年03期

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本文編號：1590405