本文選題：肝細(xì)胞癌　切入點(diǎn)：腫瘤微環(huán)境　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC;以下簡(jiǎn)稱肝癌)位于常見腫瘤的第六位及腫瘤相關(guān)性死亡原因的第三位,且近年來呈逐漸上升趨勢(shì)。雖然隨著科學(xué)技術(shù)發(fā)展和外科技巧的提高,目前大多數(shù)早期肝癌都能得到根治性切除,但其5年總體生存率仍然很低。其中最重要的因素是肝癌具有極強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,術(shù)后5年內(nèi)極易出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。所以,肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是我們治療肝癌的臨床難題。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中由腫瘤細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)相互作用后形成的有利于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的特殊環(huán)境,其組成成分包括腫瘤細(xì)胞、多種間質(zhì)及炎性細(xì)胞、可溶性細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)等。腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移的整個(gè)過程中扮演著重要的角色。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂虚g質(zhì)表型細(xì)胞特點(diǎn)的生物學(xué)過程,目前廣泛認(rèn)為EMT是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要方式。趨化因子作為腫瘤微環(huán)境的一種成分,也參與了多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。目前文獻(xiàn)證明,趨化因子能夠以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變的方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移。CCL20,又被稱為人巨噬細(xì)胞炎性蛋白3α(Macrophage inflammatory protein-3α),作為近年來研究熱點(diǎn)的細(xì)胞因子,已被證明在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起到非常重要的作用,其在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中也扮演非常重要的角色。已有學(xué)者發(fā)現(xiàn),CCL20可以與白介素8(Interleukin-8,又名CXCL8)協(xié)同作用,通過介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT樣改變,促進(jìn)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。另一方面,我們的前期研究結(jié)果顯示,肝癌微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)能夠顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,推測(cè)可能是由于腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞通過自分泌方式影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。研究表明,腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞能夠分泌包括趨化因子CCL20在內(nèi)的多種細(xì)胞因子。細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是一種細(xì)胞程序化死亡(Programmed cell death,PCD),是指在一定的病理及生理?xiàng)l件下,細(xì)胞遵循于自身程序的生理性死亡過程。細(xì)胞凋亡被抑制是腫瘤細(xì)胞存活并發(fā)生轉(zhuǎn)移的先決條件。研究證實(shí),趨化因子與細(xì)胞凋亡在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中亦發(fā)揮作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子相關(guān)因子1(Vascular endothelial growth factor-correlated chemokine 1,VCC-1)作為一種趨化因子,被證實(shí)與肝癌細(xì)胞增殖能力呈正相關(guān),并且抑制腫瘤細(xì)胞凋亡�；谏鲜鲅芯勘尘�,我們推測(cè),肝癌微環(huán)境中趨化因子CCL20亦可能通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT的方式促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移,同時(shí)抑制肝癌細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證此假說,本課題主要從以下幾個(gè)方面開展研究:1、檢測(cè)正常肝細(xì)胞LO2和多種肝癌細(xì)胞系包括Hep G2、MHCC-97H、Hep3B、SMMC-7721和Huh7中CCL20蛋白表達(dá)情況,并篩選高表達(dá)肝癌細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);2、分別采用細(xì)胞因子CCL20和干擾載體si RNA-CCL20處理肝癌細(xì)胞,觀察肝癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)以及生物學(xué)特性改變,采用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)肝癌細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白(E-cadherin、Vimentin)表達(dá)差異;3、采用MTT、Transwell及Wound-healing等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CCL20/si RNA-CCL20處理后肝癌細(xì)胞侵襲遷移能力的改變;4、采用Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白及信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化,探討可能涉及的信號(hào)通路和分子機(jī)制;5、采集臨床肝癌組織標(biāo)本,采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肝癌組織以及配對(duì)癌旁肝組織中CCL20蛋白以及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況;6、收集相關(guān)肝癌患者的臨床病理學(xué)資料,并隨訪,進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,獲得CCL20與肝癌患者臨床相關(guān)指標(biāo)、EMT相關(guān)標(biāo)志物以及肝癌患者臨床預(yù)后之間的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本課題主要分為三個(gè)部分:第一部分CCL20通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移目的:獲取CCL20誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變促進(jìn)其侵襲和轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。方法:首先通過Western blot方法檢測(cè)正常肝細(xì)胞LO2與不同肝癌細(xì)胞系(Hep G2、MHCC-97H、Hep3B、SMMC-7721和Huh7)中的CCL20蛋白表達(dá),得到高表達(dá)CCL20蛋白的肝癌細(xì)胞系,然后通過MTT、Transwell等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CCL20對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的變化,同時(shí)用外源性細(xì)胞因子CCL20與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)后,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。結(jié)果:Western blot檢測(cè)肝癌細(xì)胞中CCL20蛋白的表達(dá)顯著高于正常肝細(xì)胞,且Hep3B中的CCL20蛋白表達(dá)量最高,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CCL20能夠促進(jìn)肝癌Hep3B細(xì)胞體外增殖作用,并且有時(shí)間依賴性及劑量依賴性;Transwell實(shí)驗(yàn)證明,CCL20可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲能力,并且與CCL20濃度呈正相關(guān);將CCL20與肝癌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,肝癌細(xì)胞形態(tài)形態(tài)發(fā)生了明顯變化,細(xì)胞間隙增加,細(xì)胞形態(tài)從多邊立方形轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形的EMT樣改變。結(jié)論:CCL20能夠通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲及增殖能力。第二部分下調(diào)CCL20表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移和凋亡等生物學(xué)特性目的:驗(yàn)證si RNA-CCL20具有抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移和凋亡等生物學(xué)特性的作用。方法:首先通過MTT、Transwell、細(xì)胞劃痕等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)si RNA-CCL20對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移能力的影響;然后通過細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)下調(diào)趨化因子CCL20后肝癌細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白(E-cadherin、Vimentin)表達(dá)情況的變化;接下來采用Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白及可能存在的信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化;最后應(yīng)用Western blot及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)si RNA-CCL20對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:MTT、Transwell、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白組和質(zhì)粒對(duì)照組相比較,si RNA-CCL20能夠?qū)Ω伟〩ep3B細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力具有顯著的抑制作用;si RNA-CCL20處理肝癌Hep3B細(xì)胞48 h后,肝癌細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白(Vimentin)表達(dá)下調(diào),上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達(dá)上升,p-Akt表達(dá)上調(diào),而p-ERK幾乎無變化;Western blot及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,相比較于空白對(duì)照組和質(zhì)粒對(duì)照組,si RNA-CCL20處理組的肝癌Hep3B細(xì)胞凋亡率顯著增加,與此同時(shí)凋亡相關(guān)指標(biāo)Cleaved caspase-3表達(dá)量增高,而B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表達(dá)量降低。結(jié)論:下調(diào)肝癌細(xì)胞中CCL20表達(dá)能夠顯著抑制肝癌Hep3B細(xì)胞增殖、侵襲遷移和凋亡等生物學(xué)特性,可能通過PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮作用。第三部分肝癌組織高表達(dá)CCL20蛋白是預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后的一個(gè)潛在指標(biāo)目的:研究肝癌組織中CCL20、EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平與臨床病理學(xué)指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性。方法:采用免疫組化法檢測(cè)CCL20、E-cadherin及Vimentin在肝癌組織及配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)水平,并根據(jù)CCL20染色程度將102例肝癌患者分為高表達(dá)組及低表達(dá)組,然后分別將其與EMT相關(guān)蛋白、患者的臨床病理學(xué)資料進(jìn)行相關(guān)性分析;采用多因素回歸分析預(yù)測(cè)肝癌不良預(yù)后的指標(biāo),并通過采用Kaplan-Meier法和Log-Rank檢驗(yàn)對(duì)比兩組患者的總生存率及無復(fù)發(fā)生存率。結(jié)果:CCL20蛋白表達(dá)于肝癌細(xì)胞胞漿內(nèi),在肝癌組織中的陽性表達(dá)率為77.45%(79/102),在癌旁肝組織中的陽性表達(dá)率為20.59%(21/102)。CCL20蛋白陽性表達(dá)的肝癌組E-cadherin表達(dá)降低,Vimentin表達(dá)增加。102個(gè)患者可分為CCL20蛋白高表達(dá)組(64/102)和低表達(dá)組(38/102),其高表達(dá)CCL20組與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(13/64,20.31%,P0.001),而與Vimentin表達(dá)呈正相關(guān)(60/64,93.75%,P0.001)。進(jìn)一步與患者的臨床病理學(xué)資料相關(guān)性分析得出,CCL20蛋白表達(dá)與腫瘤大小(P=0.001)、血管侵犯(P=0.025)、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移(P=0.002)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.000)具有顯著相關(guān)性。多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn),CCL20蛋白表達(dá)、血管侵犯、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能夠顯著影響肝癌患者的總生存率和無瘤生存率。與低表達(dá)CCL20蛋白組相比,高表達(dá)組總生存率(P=0.011)和無復(fù)發(fā)生存率(P=0.008)均顯著減少。結(jié)論:肝癌組織中CCL20蛋白表達(dá)顯著增高,與EMT相關(guān)蛋白表達(dá)改變存在相關(guān)性,并且肝癌組織中CCL20蛋白表達(dá)增高與肝癌術(shù)后預(yù)后不良呈相關(guān)性,有可能作為臨床預(yù)后預(yù)測(cè)的一個(gè)新靶標(biāo)。全文結(jié)論:CCL20蛋白在肝癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),并且通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變及抑制細(xì)胞凋亡的方式增強(qiáng)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力,其機(jī)制可能是通過PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控。臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證明,CCL20蛋白在肝癌組織中高表達(dá),且與EMT標(biāo)志物相關(guān)蛋白存在相關(guān)性。CCL20蛋白表達(dá)水平與肝癌臨床病理指標(biāo)及患者的總體生存率和無復(fù)發(fā)生存率存在明顯的相關(guān)性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 遲寧;喝咖啡可降低肝癌的發(fā)病率[J];日本醫(yī)學(xué)介紹;2005年05期

2 吳孟超;;肝癌外科治療的近期進(jìn)展[J];中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志;2006年02期

3 張志敏;;肝癌會(huì)遺傳嗎?[J];肝博士;2006年03期

4 徐連根;周晶;雷偉;沈志祥;;瘦素及其受體在肝癌組織中的表達(dá)及意義[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2006年05期

5 魏麗珍;李勝棉;張楠;溫登瑰;周燁;王士杰;;688例肝癌患者發(fā)病特點(diǎn)及診療狀況分析[J];肝臟;2010年02期

6 ;我國(guó)科研人員發(fā)現(xiàn)促進(jìn)肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因[J];臨床薈萃;2010年10期

7 吳生;;盤點(diǎn)誘發(fā)肝癌的7大元兇[J];肝博士;2012年01期

8 鄧慶華;一家四例肝癌報(bào)道[J];中國(guó)廠礦醫(yī)學(xué);1995年06期

9 王定珠;;觥籌交錯(cuò) 過度疲勞 肝癌乘機(jī)而入[J];健康博覽;2005年11期

10 笑山,吳蓉蓉;喝咖啡可以減少肝癌發(fā)生率[J];健康之路;2005年04期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 俞順章;穆麗娜;;飲水中藻類毒素與肝癌關(guān)系和控制的研究(摘要)[A];全國(guó)腫瘤流行病學(xué)和腫瘤病因?qū)W學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

2 楊秉輝;;肝癌預(yù)防的新話題-非酒精性脂肪性肝病與肝癌[A];第十二屆全國(guó)肝癌學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

3 丁光偉;楊玉秀;徐秋霞;徐存拴;;肝癌多基因表達(dá)異常初步研究[A];第五屆全國(guó)肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

4 吳孟超;;肝癌外科治療的近期進(jìn)展[A];第三屆全國(guó)重型肝病及人工肝血液凈化學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（上冊(cè)）[C];2007年

5 劉耕陶;孫華北;方亞南;;肝癌發(fā)生的化學(xué)預(yù)防[A];第十次中國(guó)生物物理學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2006年

6 阮秀花;田蔥;張效本;張喜梅;;肝癌患者乙型肝炎病毒感染血清流行病學(xué)分析[A];第五屆全國(guó)肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

7 阮秀花;田蔥;張效本;張喜梅;;肝癌患者乙型肝炎病毒感染血清流行病學(xué)分析[A];第五屆全國(guó)肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

8 呂巖;韓學(xué)鋒;;肝癌患者需求的評(píng)估[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)工程學(xué)分會(huì)第八次學(xué)術(shù)年會(huì)暨《醫(yī)療設(shè)備信息》創(chuàng)刊20周年慶祝會(huì)論文集[C];2006年

9 孫華;魏懷玲;劉耕陶;;雙環(huán)醇對(duì)化學(xué)毒物促發(fā)肝癌的防治作用及作用機(jī)制研究[A];2009醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十一屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

10 謝靜媛;戴煒;涂愛民;趙文高;符花;胡應(yīng)龍;;深圳地區(qū)53例肝癌發(fā)生的相關(guān)因素探討[A];全國(guó)第2屆中西醫(yī)結(jié)合傳染病學(xué)術(shù)會(huì)議暨國(guó)家中醫(yī)藥管理局第1屆傳染病協(xié)作組會(huì)議論文匯編[C];2008年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 湖北宜昌 胡獻(xiàn)國(guó);吸煙與肝癌[N];上海中醫(yī)藥報(bào);2013年

2 四川成都 孫清廉;遠(yuǎn)離肝癌 謹(jǐn)防四大危險(xiǎn)因素[N];上海中醫(yī)藥報(bào);2013年

3 特約撰稿 北京朝陽醫(yī)院京西院區(qū)肝膽外科主任 孫文兵;警惕肝癌的過度治療[N];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2007年

4 健康時(shí)報(bào)特約記者 孫理;三招不得肝癌[N];健康時(shí)報(bào);2008年

5 葉建平;專家提醒肝癌患者保護(hù)生命 重在“三早”防治[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2008年

6 通訊員 韋夏 本報(bào)記者 鄧宏鷹 鐘少鴻;不良飲食習(xí)慣易誘發(fā)肝癌[N];中國(guó)食品報(bào);2009年

7 記者 顧泳;我國(guó)肝癌患者占全球55%[N];解放日?qǐng)?bào);2010年

8 解放軍302醫(yī)院 劉士敬;四成肝癌酒精泡出來的[N];健康時(shí)報(bào);2010年

9 記者 顏維琦 曹繼軍;我科學(xué)家揭示肝癌發(fā)生早期分子機(jī)制[N];光明日?qǐng)?bào);2012年

10 記者 胡德榮;肝癌發(fā)生早期階段分子機(jī)制被揭示[N];健康報(bào);2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 陳放;TOPK蛋白和肝癌發(fā)生以及相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

2 張怡安;中樞神經(jīng)特異性RNA結(jié)合蛋白NOVA1在肝癌中的表達(dá)及其促進(jìn)腫瘤發(fā)展的潛在分子機(jī)制探究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

3 殷杰;E3泛素連接酶Prp19對(duì)肝癌侵襲的影響及其機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

4 周宇紅;分化抑制因子ID1在調(diào)控化療誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞“干性”改變中的作用研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

5 王盛;FOXA1基因變異和調(diào)控異常促，

本文編號(hào)：1587274