本文選題：肝細(xì)胞肝癌　切入點(diǎn)：pERK　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景：肝癌是僅次于肺癌的全球第二大癌癥死因,具有起病隱匿、復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)的特點(diǎn)。近年來,分子靶向藥物在腫瘤治療領(lǐng)域越來越受到關(guān)注,其在中晚期肝癌治療上也表現(xiàn)出獨(dú)特的抗癌效果。索拉非尼是第一個(gè)被美國FDA批準(zhǔn)用于治療中晚期肝癌的分子靶向藥物。但在臨床運(yùn)用中,索拉非尼的有效性受到了極大挑戰(zhàn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,在亞洲人群中,只有小部分病例對(duì)索拉非尼治療敏感,而大部分患者經(jīng)索拉非尼治療后出現(xiàn)耐藥,有的甚至?xí)霈F(xiàn)肝癌進(jìn)展。因此,深入研究索拉非尼治療肝癌的分子機(jī)制,探索肝癌對(duì)索拉非尼敏感性相關(guān)分子,從而進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)有效可靠的生物靶標(biāo),對(duì)肝癌的個(gè)體化治療無疑具有非常重要的意義。雖然目前對(duì)于索拉非尼治療肝癌的敏感性相關(guān)生物靶標(biāo)已經(jīng)有了較多的探索,陸續(xù)有文章報(bào)道認(rèn)為VEGFA、VEGF、αB-Crystallin、FGF3/FGF4、Nanog、 EGFR/HER-3、STAT3等都可能是肝癌對(duì)索拉非尼敏感性相關(guān)的候選生物靶標(biāo)。但是這些研究仍有缺陷,一方面沒有系統(tǒng)的闡明兩者之間的關(guān)系,另一方面,作為肝癌對(duì)索拉非尼敏感性的分子靶標(biāo),其依據(jù)也不夠充分。探尋一種確實(shí)可靠的敏感性標(biāo)記分子對(duì)于索拉非尼的個(gè)體化肝癌治療是非常亟需的。目的：本課題旨在研究肝癌pERK水平與索拉非尼的敏感性關(guān)系。在對(duì)索拉非尼敏感性不同的肝癌患者中,比較pERK的蛋白水平,據(jù)此觀察肝癌pERK蛋白水平與索拉非尼敏感性之間的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上,通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)以及CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)篩選肝癌對(duì)索拉非尼敏感性相關(guān)的關(guān)鍵基因,從而為肝癌的個(gè)體化治療提供借鑒。方法：1.收集經(jīng)索拉非尼治療的肝癌患者臨床資料,觀察索拉非尼對(duì)不同pERK蛋白水平肝癌的敏感性。2.比較不同pERK蛋白水平的肝癌細(xì)胞系對(duì)索拉非尼的敏感性。3.建立病人來源移植瘤模型(PDX模型),進(jìn)一步在臨床標(biāo)本水平驗(yàn)證不同pERK蛋白水平對(duì)索拉非尼的敏感性。4.建立鼠來源異體皮下移植瘤模型(Syngenic模型),進(jìn)一步在動(dòng)物水平驗(yàn)證不同pERK水平細(xì)胞系的移植瘤對(duì)索拉非尼的敏感性。5.建立裸鼠原位移植瘤模型(orthotopic模型),進(jìn)一步在動(dòng)物水平驗(yàn)證不同pERK水平細(xì)胞系的原位移植瘤對(duì)索拉非尼的敏感性。6.建立DDBlF/F;Alb-Cre~(+/-)小鼠自發(fā)性肝癌模型,檢測pERK水平和對(duì)索拉非尼的敏感性。7.建立DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌模型,檢測pERK水平和對(duì)索拉非尼的敏感性。8.通過蘇木精伊紅染色和免疫組織化學(xué)染色,比較臨床資料中不同pERK水平肝癌的病理學(xué)差異。9.通過蘇木精伊紅染色和免疫組織化學(xué)染色,比較DDBlFF;Alb-Cre~(+/-)小鼠自發(fā)性肝癌模型和DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌模型的病理學(xué)差異。10.通過轉(zhuǎn)錄組測序,比較pERK高和pERK低的PDX模型中基因表達(dá)改變。11.通過轉(zhuǎn)錄組測序,比較pERK高(HepG2)和pERK低(Li-0010)肝癌細(xì)胞系的基因表達(dá)差異。12.在病人標(biāo)本中,通過qPCR的方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果。13.通過對(duì)索拉非尼敏感的HepG2細(xì)胞進(jìn)行CRISPR-Cas9全基因組敲除篩選其敏感基因。14.在HepG2細(xì)胞中改變篩選得到的候選基因的表達(dá),觀察對(duì)索拉非尼敏感性的影響。15.用免疫組織化學(xué)以及免疫熒光染色法,檢測pERK和PDl在臨床肝癌病人標(biāo)本中的水平。結(jié)果：1.索拉非尼對(duì)pERK水平高的肝癌患者更加敏感。2.體外實(shí)驗(yàn)證明pERK高的肝癌細(xì)胞系HepG2、Hepal-6比pERK低的肝癌細(xì)胞系Be17404.Hepalclc7對(duì)索拉非尼更加敏感。3.在PDX模型中,索拉非尼對(duì)pERK蛋白水平高的肝癌模型個(gè)體更加敏感。4.將pERK高的肝癌細(xì)胞系Hepal-6和pERK低的肝癌細(xì)胞系Hepalcl c7分別種植到C57BL/6J小鼠建立Syngenic模型,發(fā)現(xiàn)兩者在小鼠體內(nèi)微環(huán)境下的pERK蛋白水平均升高。5.將pERK高的肝癌細(xì)胞系HepG2和pERK低的肝癌細(xì)胞系Bel7404分別種植到裸鼠肝臟建立orthotopic模型,發(fā)現(xiàn)兩者在裸鼠肝體內(nèi)微環(huán)境下的pERK蛋白水平均有改變。6.DDBlF/F;Alb-Cre~(+/-)小鼠自發(fā)性肝癌模型pERK含量低,對(duì)索拉非尼不敏感。7.DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌模型pERK含量高,對(duì)索拉非尼較敏感。8.臨床資料病理結(jié)果顯示pERK水平低的肝癌炎癥細(xì)胞浸潤更加明顯,尤其以PD1~+CD8~+T細(xì)胞為主。9.DDBlFF:Alb-Cret~(+/-)小鼠自發(fā)性肝癌模型較DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌模型表現(xiàn)出更多的炎癥細(xì)胞浸潤,以PD1~+CD8~+T細(xì)胞為主。10.轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示pERK低的較pERK高的PDX模型具有更強(qiáng)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化傾向。11.轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示pERK低的(Li-0010)比pERK高的(HepG2)肝癌細(xì)胞系具有更強(qiáng)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化傾向。12.在病人標(biāo)本中,mRNA水平進(jìn)一步證明pERK低的比pERK高的肝癌具有更強(qiáng)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化傾向。13. KEAP1可能在HepG2對(duì)索拉非尼的敏感性中發(fā)揮了比較大的作用。14.敲除了KEAP1的HepG2細(xì)胞對(duì)索拉非尼不敏感。15.pERK低同時(shí)伴PD1~+的肝癌患者在所有肝癌中占了多數(shù)。結(jié)論：1.索拉非尼對(duì)pERK蛋白水平高的肝癌患者更加敏感。2. pERK蛋白水平低的肝癌炎癥細(xì)胞浸潤更加明顯,尤其以PD1~+CD8~+T細(xì)胞為主。3. pERK低的肝癌較pERK高的肝癌具有更強(qiáng)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化傾向。4. KEAP1可能在pERK含量高的肝癌對(duì)索拉非尼的敏感性中發(fā)揮了比較大的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1585335