本文選題：miR-26b　切入點：EphA2　出處：《山東大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是各國都比較常見的一種惡性腫瘤。近幾年,肝癌的發(fā)病率明顯上升,人們的生活、健康受到了嚴重威脅。盡管引發(fā)肝癌的危險性因子都已得到很好的研究,但是對該癌癥發(fā)生的病理機制并不很清楚。隨著越來越多的人被肝癌奪走了珍貴的生命,人們迫切需要對肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機制有更多的了解以便開發(fā)出治療肝癌的有效方法。MicroRNAs (miRNAs),是內(nèi)源性單鏈的非編碼RNAs,長約19-25核苷酸,它們通過直接結合3’非編碼區(qū)(3’UTR)目標信使RNA(mRNA),使這些mRNA翻譯抑制或直接降解,從而調(diào)控下游相關基因的表達。研究表明,miRNAs參與了多階段發(fā)育過程,包括胚胎發(fā)生、發(fā)展、細胞增殖、細胞凋亡等。越來越多的研究證實,大量miRNAs在癌癥組織細胞中異常表達,作為癌基因或抑癌基因,它們在各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的調(diào)控作用。因此,可以通過研究miRNA靶向調(diào)控它們靶基因的表達情況,為癌癥疾病探索新的治療策略。相關研究發(fā)現(xiàn),大量miRNAs在HCC中存在異常表達的情況,例如：有研究證實,miR-144在HCC中表達明顯下調(diào),作為腫瘤抑制miRNA的miR141,它通過靶向結合Tiaml和zinc finger E-box binding homeobox 2(ZEB2)抑制其表達從而抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。miR-302b的表達水平在臨床肝癌病人中有明顯降低,在體內(nèi)和體外的實驗中均證實miR-302b都能通過靶向結合AKT2抑制腫瘤的侵襲。miR-184作為一個致瘤性的miRNA,能在肝癌中直接靶向INPPL1基因。因此,對表達異常的miRNAs進一步研究有利于了解HCC的發(fā)生和發(fā)展。促紅細胞生成素肝細胞受體(Erythropoietin-producing hepatocellular(EPH) receptors)屬于酪氨酸激酶受體家族(receptor tyrosine kinases,RTKs)的亞家族,多種生物學過程都有這類蛋白的參與,同時在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著非常重要的作用。許多研究表明：EphA2,作為一個Eph受體家族的成員,其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和血管再生等多方面起到非常關鍵的作用。越來越多的研究表明EphA2是多種癌癥的潛在治療靶點,包括胃癌、食道鱗狀細胞癌、膠質(zhì)瘤、頭頸鱗狀細胞癌、卵巢癌、肝小膽管癌、肺癌、乳腺癌、直腸癌和前列腺癌等。例如：1i等人的研究中表明,EphA2在胃癌細胞中異常表達,并且參與了MicroRNA 520d-3p對癌細胞增值、遷移和侵襲的調(diào)控。最近研究結果表明,在肝癌細胞中EphA2也存在表達異常,并影響肝細胞癌病人的預后和生存率。fan等人的研究顯示,EphA2在肝癌細胞中過表達,并且參與肝癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。Yang等人的研究發(fā)現(xiàn),EphA2在肝癌中過表達,并與肝癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預后存在相關,但EphA2在肝癌中過表達的分子機制并不清楚。最近有研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可通過靶向結合EphA2并調(diào)節(jié)EphA2的表達,這些miRNAs包括miR-141、miR-520d-3p、miR-200a和miR-26b。以上研究表明通過調(diào)查miRNAs與EphA2的靶向關系,有利于了解肝癌的發(fā)生、發(fā)展機制并能夠為新的肝癌治療策略提供有用的信息。第一部分microRNA-26b和EphA2在肝癌細胞中的表達研究目的：本部分主要探討miR-26b和EphA2在8種肝癌細胞系(HepG2、SMMC7721、bel-7402、PLC、LM3、Huh7、97L和97H)和正常肝細胞系L02中的表達情況。研究方法：1.8種肝癌細胞系(HepG2、SMMC7721、bel-7402、PLC、LM3、Huh7、97L和97H)和正常肝細胞系L02的培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中培養(yǎng)。2. qRT-PCR分析miR-26b在8種肝癌細胞和正常肝細胞中的表達水平。3.Western blot分析EphA2在8種肝癌細胞和正常肝細胞中的表達水平。研究結果：1.與正常肝細胞相比,7種肝癌細胞(HepG2、SMMC7721、bel-7402、PLC.LM3.97L和97H)中miR-26b的表達明顯下調(diào)。2.與正常肝細胞相比,6種肝癌細胞(HepG2、SMMC7721、be1-7402、LM3、97L和97H)中EphA2的表達明顯上調(diào)。研究結論：miR-26b在肝癌中可能是一種腫瘤抑制miRNA,而EphA2可能為一種致瘤性基因,miR-26b可能會調(diào)控EphA2表達。第二部分microRNA-26b調(diào)控EphA2表達的報告基因驗證研究目的：本部分主要研究肝癌中microRNA-26b與EphA2是否存在靶向調(diào)控關系。研究方法：1.使用生物信息軟件www.microRNA.org和TargetScan預測microRNA-26b與EphA2的靶向結合位點。2.miR-26b mimics、miR-26b inhibitor和陰性對照(negative control)購買自RiboBio公司(Guangzhou,Guangdong,China)。構建EphA2突變體。3.采用雙熒光素酶報告基因驗證microRNA-26b與EphA2之間的靶向關系。研究結果：1.使用生物信息軟件www.microRNA.org和TargetScan預測,microRNA-26b能夠靶向結合EphA2。2.通過雙熒光素酶報告基因分析,我們的研究發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染miR-26b mimics能夠明顯抑制正常EphA2的熒光活性,但是對突變EphA2的熒光活性無影響。研究結論：在肝癌細胞中,miR-26b可以直接靶向結合EphA2,證明EphA2可能是miR-26b的一個靶基因。關鍵詞：雙熒光素酶報告基因；靶基因；TargetScan第三部分miR-26b下調(diào)EphA2表達影響肝癌細胞增殖、遷移和侵襲研究研究目的：研究miR-26b和EphA2的表達對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響。研究方法：miR-26b mimics、miR-26b inhibitor和陰性對照(negative control)購買自RiboBio公司(Guangzhou,Guangdong,China),并將其轉(zhuǎn)染入肝癌細胞中,分別用來過表達miR-26b、miR-26b沉默和相應陰性對照。EphA2 mimics、miR-26b和EphA2對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響分別使用Cell Counting Kit(CCK-8)、transwell invasion方法和wound healing方法進行檢測。細胞CCK8增殖能力檢測,設置時間點分別為0、12、24、48、72、96h。使用western blot分析轉(zhuǎn)錄基因c-Myc、cyclin D1表達水平。研究結果：1.我們將miR-26b mimics、EphA2 mimics和陰性對照(negative control),轉(zhuǎn)染入肝癌細胞后,24小時檢測miR-26b和EphA2的表達。我們發(fā)現(xiàn),miR-26b mimics轉(zhuǎn)染能夠明顯提高肝癌細胞中miR-26b的表達水平,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)；EphA2 mimics轉(zhuǎn)染能夠明顯提高肝癌細胞中EphA2的表達水平,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)；隨后,我們將miR-26b mimics和EphA2 mimics共轉(zhuǎn)染肝癌細胞,我們發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染miR-26b mimics和EphA2 mimics的肝癌細胞中miR-26b的表達水平明顯高于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。2.CCK-8分析揭示了miR-26b和EphA2表達對肝癌細胞增值能力的影響。結果顯示：過表達miR-26b的肝癌細胞的增殖活性從24 h開始低于對照組細胞,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01),在48 h和72 h,過表達miR-26b的肝癌細胞其增殖活性也明顯低于對照組細胞,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。但是,共轉(zhuǎn)染miR-26b mimics和EphA2 mimics細胞的增值能力與對照組細胞相比反而升高,并在48 h達到平臺期,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。3.Transwell侵襲結果表明：與對照組相比,過表達miR-26b肝癌細胞的侵襲能力明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。但是,共轉(zhuǎn)染miR-26b mimics和EphA2 mimics的細胞與對照組細胞相比其侵襲能力反而升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。4. Wound-healing結果表明：過表達miR-26b肝癌細胞的遷移能力明顯低于對照組細胞,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。但是,共轉(zhuǎn)染miR-26b mimics和EphA2 mimics的細胞與對照組細胞相比其遷移能力反而升高(p0.01)。5. Western blot結果表明：miR-26b mimics能顯著降低肝癌細胞內(nèi)EphA2、c-Myc和cyclin D1等蛋白的表達水平,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)；共轉(zhuǎn)染miR-26b mimics和EphA2 mimics的細胞與對照組細胞相比,肝癌細胞內(nèi)EphA2、c-Myc和cyclin D1的表達水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。研究結論：miR-26b能通過靶向抑制EphA2的表達來降低肝癌細胞增殖、侵襲和遷移能力,c-Myc-CyclinDl信號通路可能是實現(xiàn)這一調(diào)控作用的途徑。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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