本文選題：ZHX2　切入點：急性B淋巴細胞白血病　出處：《山東大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分ZHX2在成人急性B淋巴細胞白血病中的作用及機制研究研究背景：急性淋巴細胞白血病(ALL)是一類淋巴細胞B或者T系在骨髓內(nèi)異�？寺≡錾膼盒匝合到y(tǒng)疾病,惡性增生的原始淋巴細胞在骨髓中聚集并抑制其正常造血功能,同時浸潤骨髓外其他組織,嚴重威脅人類健康。近些年來,隨著化療和骨髓移植等治療手段的進步,兒童ALL患者的治愈率可達80%,然而成人ALL患者的治療效果仍然較差,長期生存率低于40%。急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)約為急性T淋巴細胞白血病(T-ALL)的3-4倍,約占兒童ALL的85%、成人ALL的75%。目前認為B-ALL的發(fā)生是遺傳、環(huán)境和生物等多種復雜因素共同作用的結果,具體病因不明確。因此,探索B-ALL發(fā)病機制,尋求更為有效的治療策略意義重大。ZHX2是ZHXs家族新近發(fā)現(xiàn)的一名新成員,其能夠調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄,從而參與造血細胞發(fā)育、紅細胞分化、神經(jīng)前體細胞的維持。研究表明在B細胞相關的惡性血液系統(tǒng)疾病中如多發(fā)性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤等,ZHX2發(fā)揮了非常重要的作用,與疾病的預后密切相關,發(fā)揮腫瘤抑制作用。然而,ZHX2在成人B-ALL中的作用及機制研究目前國內(nèi)外尚無報道。研究目的：檢測ZHX2在成人B-ALL患者中的表達水平,分析其與患者臨床特征和臨床預后的關系,研究ZHX2對B-ALL細胞增殖、藥物敏感性的影響,試圖闡明ZHX2對B-ALL細胞信號通路的影響,探討ZHX2對成人B-ALL治療的意義。研究方法：1.標本采集：收集37例初診成人B-ALL患者和30例正常對照者的骨髓標本。采用淋巴細胞分離液分離骨髓單個核細胞。2.實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(real-time RT-PCR)法：采用TRIzol法提取骨髓單個細胞總RNA,應用PrimeScript(?) RT Master Mix將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,應用real-time RT-PCR法檢測骨髓單個核細胞中ZHX2、 Hes1基因mRNA表達水平。3. Western Blot法：采用總蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白,SDS-PAGE凝膠電泳,應用Western Blot法檢測骨髓單個核細胞中ZHX2、Notch1、Hes1、p27蛋白水平的表達。4.細胞存活實驗：細胞進行處理后應用CCK8法檢測細胞存活情況。5.流式細胞學檢測細胞周期：應用細胞周期檢測試劑盒檢測ZHX2對細胞周期分布的影響。6.統(tǒng)計學分析：采用統(tǒng)計學軟件GraphPad Prism 5.0進行分析,實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標準差表示,實驗數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布的以中位數(shù)和范圍表示。應用Student t、 Mann-Whitney U或是Kruskal-Wallis檢驗分析B-ALL患者組和正常對照組中ZHX2、Hes1等的表達差異；應用Two-way ANOVA檢驗分析病毒轉(zhuǎn)染前后Nalm-6細胞增殖、對化療藥物敏感性的差異是否具有統(tǒng)計學意義；應用Spearman秩相關分析B-ALL患者ZHX2的表達水平與其他基因表達水平的相關性；應用Chi-square檢驗分析ZHX2表達水平與患者臨床特征間是否具有統(tǒng)計學關系；應用Kaplan-Meier生存曲線分析各組B-ALL患者的生存率,log-rank檢驗各組生存率的差異。P0.05為具有統(tǒng)計學意義差異。研究結果：1.ZHX2在初診成人B-ALL患者骨髓中的表達：Real-time RT-PCR結果顯示初診成人B-ALL患者骨髓單個核細胞中ZHX2基因mRNA表達水平明顯低于正常對照組。2.ZHX2與初診成人B-ALL患者臨床特征的相關性：(1) ZHX2 mRNA表達水平在Ph+B-ALL和Ph-B-ALL兩組中表達無明顯差異；(2) ZHX2 mRNA高表達水平與B-ALL患者低危年齡(15-39歲)密切相關；(3)在Ph+B-ALL患者組, ZHX2mRNA高表達水平與患者良好預后因素(年齡15-39歲,WBC30x109/L)密切相關；3.ZHX2與初診成人B-ALL患者臨床預后的相關性：(1)ZHX2高表達組患者總體生存時間較ZHX2低表達組明顯延長；(2)ZHX2高表達組患者CR持續(xù)時間較ZHX2低表達組延長；(3) Ph+B-ALL患者中,ZHX2高表達組患者總體生存時間較ZHX2低表達組明顯延長；4.ZHX2抑制B-ALL細胞的增殖：ZHX2過表達后,Nalm-6細胞的生長速度較空白對照組顯著下降。5.ZHX2對B-ALL細胞細胞周期的影響：ZHX2過表達后,Nalm-6細胞G0/G1期比例明顯增加,而G2/M期和S期比例無明顯改變。6.ZHX2對B-ALL細胞化療藥物敏感性的影響：ZHX2過表達后,化療藥物地塞米松和去甲氧柔紅霉素對Nalm-6細胞生長的抑制率明顯增高,并呈劑量效應關系。7.ZHX2對B-ALL細胞信號通路的影響：(1)ZHX2過表達可導致p27蛋白水平明顯增加；(2)ZHX2過表達可導致Notchl分子的激活增加,但是Hes1蛋白水平輕度降低；(3)ZHX2與Hes1在蛋白水平存在相互作用。結論：1.初診成人B-ALL患者ZHX2 mRNA表達水平顯著低于正常對照者；2.ZHX2表達水平與初診成人B-ALL患者的臨床特征和臨床預后密切相關；3.ZHX2抑制B-ALL細胞增殖,同時增加細胞對化療藥物的敏感性,提示其腫瘤抑制作用；4.進一步探索ZHX2在B-ALL細胞中的作用,可能為B-ALL的治療開辟新途徑。第二部分異常Th亞群與淋巴瘤臨床相關性研究研究背景：淋巴瘤是一組起源于淋巴結或是結外淋巴組織的惡性血液系統(tǒng)疾病,約占世界惡性腫瘤的3%-5%。按組織病理學,淋巴瘤可分為霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；按細胞來源,其可分為B細胞淋巴瘤和T細胞淋巴瘤。近年來,隨著診斷和治療手段的發(fā)展,淋巴瘤的預后得到一定改善,但是仍有部分患者治療效果不佳。淋巴瘤也屬于免疫系統(tǒng)惡性腫瘤,其病因和發(fā)病機制目前仍不完全清楚。研究表明T細胞的異常表達與機體的免疫功能紊亂以及一些血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。Th17和Th22細胞為近年來新發(fā)現(xiàn)的兩類T輔助(Th)細胞,研究證實它們不僅在外周免疫反應中發(fā)揮著重要作用,而且在肝癌、胃癌和肺癌等惡性腫瘤中也發(fā)揮著不可忽視的作用。然而,國內(nèi)外尚無有關Th17和Th22細胞在淋巴瘤中的詳細報道。研究目的：在本研究中,我們檢測了淋巴瘤患者外周血中Th1、Th17和Th22細胞的比例,以及Th亞群相關細胞因子在外周血血清中的分泌情況,研究上述Th亞群與淋巴瘤患者臨床特征和疾病進展的關系,為進一步研究Th1、Th17和Th22細胞在血液系統(tǒng)腫瘤免疫機制中的作用提供基本資料。研究方法：1.標本采集：收集57例淋巴瘤患者和39例正常對照者的外周血標本,采用差速離心法分離出外周血上清。2.流式細胞學技術：新鮮外周血經(jīng)過PMA、離子霉素和莫能霉素刺激后,應用流式細胞學技術檢測Th1、Th17和Th22細胞在患者和正常對照者外周血中所占比例。3.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法：血清離心去細胞碎片后分裝并儲存于-80℃,應用ELISA方法檢測血清中IL-17AA、IL-17FF、IL-17AF、IL-22和IL-6蛋白的分泌。4.統(tǒng)計學分析：采用統(tǒng)計學軟件GraphPad Prism 5.0進行分析,P0.05為具有統(tǒng)計學意義差異。研究結果：1.初診淋巴瘤患者外周血中Th1、Th17和Th22細胞水平：(1) Thl (CD4+IFN-y+)細胞在初診淋巴瘤患者外周血中的比例較正常對照組明顯增多；(2)與正常對照組相比,Th1細胞在初診B-NHL患者組和T-NHL患者組外周血中的比例顯著升高,而初診HL患者組無明顯改變；(3) Th17 (CD4+IL-17+)細胞在初診淋巴瘤患者外周血中的比例較正常對照組明顯減少；(4)與正常對照組相比,Thl7細胞僅在初診B-NHL患者組外周血中的比例顯著下降,而初診T-NHL患者和HL患者組無明顯改變。(5) Th22 (CD4+IFN-γIL-17TL-22+)細胞在初診淋巴瘤患者外周血中的比例較正常對照組明顯上升；(6)與正常對照組相比,Th22細胞在初診B-NHL患者組和T-NHL患者組外周血中的比例顯著升高,而初診HL患者組無明顯改變；2.初診B-NHL患者外周血上清中Th17、Th22相關細胞因子水平：(1)初診B-NHL患者血清中IL-17AF濃度顯著低于正常對照者,而IL-17AA血清濃度在初診B-NHL患者組與正常對照組間無明顯差異。此外,IL-17FF在初診B-NHL患者和正常對照者外周血上清中均檢測不出。(2)初診B-NHL患者血清中IL-22和IL-6濃度明顯高于正常對照組。3. Spearman相關分析得出,初診B-NHL患者外周血中Th22細胞比例與Th17細胞比例呈正相關。4. B-NHL高年齡組(60歲)患者外周血中Th22細胞比例較低年齡組(S60歲)顯著增高。5. Th1、Th17和Th22細胞與B-NHL患者疾病發(fā)展的關系：(1) B-NHL患者外周血Thl細胞比例在化療后較初診時明顯降低,并較正常對照者無明顯差別。Thl細胞比例在復發(fā)B-NHL患者與初診B-NHL患者間無明顯差異。(2) B-NHL患者外周血Th17細胞比例在化療后較初診時明顯升高,并較正常對照者無明顯差別。Th17細胞在復發(fā)B-NHL患者外周血中比例較初診B-NHL患者和正常對照者均顯著增高。(3) B-NHL患者外周血Th22細胞比例在化療后較初診時明顯降低,并較正常對照者無明顯差別。Th22細胞在復發(fā)B-NHL患者外周血中比例較初診B-NHL患者顯著增高。結論：1. Th1、Th17和Th22細胞在淋巴瘤尤其是B-NHL患者中異常表達。2. B-NHL患者經(jīng)過化療后,異常表達的Th1、Th17和Th22細胞趨于正常化。3. Th1、Th17和Th22細胞與B-NHL患者臨床特征和疾病進展具有一定的相關性。4.進一步研究Th亞群在血液系統(tǒng)腫瘤免疫機制中的作用,可以為血液系統(tǒng)腫瘤的治療開辟新途徑。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.71
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本文編號：1585460