本文選題：3　切入點：6-DHF　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：乳腺癌(breast cancer,BC)作為女性最常見的惡性腫瘤,已經(jīng)嚴(yán)重威脅到全世界女性的身心健康,給社會和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。因此,關(guān)于乳腺癌的防治研究就顯得尤為重要。流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),膳食因素與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。課題組前期利用藥效學(xué)實驗方法,對常見的類黃酮化合物進行篩選,發(fā)現(xiàn)3,6-二羥黃酮(3,6-dihydroxyflavone,3,6-DHF)能夠顯著抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展,其抗腫瘤活性較強。3,6-DHF廣泛存在于蔬菜水果中,其抗腫瘤活性由許多實驗研究所證實,但其具體機制仍不是非常清楚。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)發(fā)揮關(guān)鍵性作用。EMT的分子過程十分復(fù)雜,主要表現(xiàn)在E-cadherin(E-鈣黏蛋白)表達降低,Snail、Slug、Twist和N-cadherin表達升高。EMT與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),許多研究已經(jīng)證明,EMT激活后,可促進許多腫瘤(乳腺癌、胃癌、前列腺癌、宮頸癌等)的生長和轉(zhuǎn)移。眾所周知,乳腺癌干細(xì)胞(breast cancer stem cells,BCSCs)是一類自我更新能力和多向分化能力強的多潛能細(xì)胞,在腫瘤復(fù)發(fā)、耐藥性、抗化療性及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。乳腺癌細(xì)胞中,具有ALDH+表型或CD44+CD24-表型的細(xì)胞表現(xiàn)出干細(xì)胞特性,自我更新與多向分化能力強,為腫瘤的防治研究帶來了挑戰(zhàn)。近期研究表明EMT在腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)形成環(huán)節(jié)發(fā)揮了關(guān)鍵性作用,EMT可以促進腫瘤干細(xì)胞的產(chǎn)生,CSCs也可以通過一些相關(guān)的信號通路促進腫瘤細(xì)胞的EMT,兩者相互依賴、相互促進。本研究發(fā)現(xiàn)3,6-DHF可從體內(nèi)外有效地抑制乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT,顯著抑制腫瘤干細(xì)胞的形成和增長,同時通過體內(nèi)模型證實3,6-DHF抑制乳腺癌細(xì)胞發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。調(diào)控EMT的信號通路有很多種,Notch信號通路在其中發(fā)揮了重要的作用。最近的研究表明,激活Notch信號通路,可有效地促進腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT和BCSCs的形成,在乳腺癌發(fā)生EMT過程中發(fā)揮核心作用。Notch信號通路活化后,Notch受體與Jagged配體結(jié)合后,在γ-分泌酶的作用下,釋放NICD(Notch1活化胞內(nèi)域)。NICD-MAML(mastermind-like)-CSL(C-promoter binding factor-1)復(fù)合體活化后,促進下游靶基因的表達,從而促進EMT。其中,乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中,也會涉及一系列mi RNA的表達變化。研究發(fā)現(xiàn),P53的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)靶點mi R-34a,可直接與Notch1的m RNA結(jié)合,抑制Notch信號通路,進而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。基于上述分析,我們提出研究假說:3,6-DHF可能通過抑制Notch信號通路,抑制乳腺癌發(fā)生EMT。本研究探討3,6-DHF能否通過增強mi R-34的表達來調(diào)節(jié)Notch信號通路的相關(guān)蛋白的表達。闡明3,6-DHF通過調(diào)控Notch信號通路,抑制乳腺癌發(fā)生EMT進而抑制乳腺癌發(fā)生的機制。本課題通過蛋白免疫印跡(western blot,WB)和免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence analysis,IF)分析3,6-DHF對乳腺癌細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白及Notch信號通路相關(guān)蛋白的表達的影響。使用轉(zhuǎn)染熒光報告基因的MDA-MB-231細(xì)胞(Luc-MDA-MB-231)構(gòu)建裸鼠移植瘤模型,利用活體成像儀(IVIS),定量分析3,6-DHF對移植瘤熒光量表達的抑制效應(yīng)。通過免疫組化技術(shù)(immunohistochemical analysis,IHC)分析3,6-DHF對乳腺移植瘤EMT標(biāo)志蛋白和Notch通路相關(guān)蛋白表達的影響。采用ALDEFLOUR○R分析法、微球體成球?qū)嶒灪虲CK-8(cell counting kit-8)法分析3,6-DHF對BCSCs的抑制效應(yīng)。利用Transwell侵襲和遷移實驗、細(xì)胞劃痕實驗明確3,6-DHF抑制體外乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。利用Luc-MDA-MB-231細(xì)胞,構(gòu)建裸鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移模型,通過活體成像儀和HE染色(hematoxylin-eosin staining)觀察3,6-DHF膳食干預(yù)對體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力的抑制效應(yīng)。利用WB技術(shù),觀察3,6-DHF對NICD-CSL-MAML轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的抑制。采用WB、轉(zhuǎn)染及Transwell遷移和侵襲實驗等技術(shù)進一步明確3,6-DHF通過調(diào)控mi R-34a抑制Notch信號通路及下游蛋白Snail、Twist、Slug和E-cadherin的表達,進而抑制乳腺癌發(fā)生EMT的作用。實驗結(jié)果:1.3,6-DHF抑制乳腺癌細(xì)胞EMT和BCSCs的形成(1)WB結(jié)果顯示:不同濃度3,6-DHF(0μM、5μM、10μM和20μM)處理乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞,隨3,6-DHF濃度增加,EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達逐漸增強,N-cadherin、Twist、Snail和Slug的表達逐漸減弱。TGF-β(10ng/ml)可顯著增強EMT相關(guān)蛋白的表達。同樣,免疫熒光結(jié)果顯示,3,6-DHF劑量增加,Snail表達水平逐漸降低,E-cadherin表達水平逐漸升高。(2)Luc-MDA-MB-231皮下接種到BALB/c雌性裸鼠肩胛下,構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。分別在接種后1W、2W和4W時,用活體成像儀對裸鼠移植瘤熒光量進行定量分析。結(jié)果顯示3,6-DHF(20mg/kg)組裸鼠移植瘤熒光量高于對照組,并且隨著3,6-DHF作用時間的延長,裸鼠移植瘤熒光量逐漸增加。取出4W處理后的裸鼠移植瘤進行稱重、測量體積,結(jié)果表明3,6-DHF(20mg/kg)組移植瘤體積和重量明顯小于對照組。免疫組化染色結(jié)果顯示3,6-DHF(20mg/kg干預(yù)顯著降低Snail、Twist和Slug的表達,增加E-cadherin的表達。(3)流式細(xì)胞儀分析結(jié)合ALDEFLOUR○R分析法檢測乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞中ALDH+細(xì)胞的比例,結(jié)果顯示隨著3,6-DHF濃度增加,ALDH+細(xì)胞的比例逐漸下降,3,6-DHF降低BCSCs的比例。微球體成球?qū)嶒灲Y(jié)果顯示3,6-DHF可以明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的成球能力。CCK-8試劑盒測定乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和SUM-159中ALDH+細(xì)胞的活力,結(jié)果顯示隨著3,6-DHF濃度的增加,乳腺癌干細(xì)胞的活力明顯降低。(4)流式細(xì)胞技術(shù)檢測BALB/c裸鼠移植瘤BCSCs的比例。3,6-DHF(20mg/kg)組移植瘤BCSCs的比例明顯低于對照組。提取對照組和3,6-DHF(20mg/kg)組的移植瘤細(xì)胞,皮下接種到NOD/SCID小鼠,觀察NOD/SCID小鼠成瘤情況。結(jié)果顯示:對照組的6只小鼠中有5只成瘤,而3,6-DHF處理組僅有1只小鼠成瘤。2.3,6-DHF體內(nèi)外抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲(1)Transwell遷移實驗結(jié)果顯示隨著3,6-DHF濃度的增加,穿過聚碳酸酯膜的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量明顯降低,并且穿過聚碳酸酯膜的MDA-MB-231細(xì)胞的數(shù)量要高于MCF-7細(xì)胞的數(shù)量。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示,穿過聚碳酸酯膜的MDA-MB-231細(xì)胞的數(shù)量比MCF-7細(xì)胞的數(shù)量多,并且隨3,6-DHF濃度的增加,細(xì)胞數(shù)量降低。細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示,乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7的劃痕愈合率隨3,6-DHF濃度的增高,逐漸下降,并且兩種乳腺癌細(xì)胞的劃痕愈合率在24h時明顯高于12h。(2)通過尾靜脈注射Luc-MDA-MB-231細(xì)胞(1×106)于BALB/c裸鼠內(nèi),構(gòu)建裸鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移模型。3,6-DHF(20mg/kg)處理5周后,結(jié)果顯示對照組中5只裸鼠全部發(fā)生肺轉(zhuǎn)移,而3,6-DHF實驗組僅有1只發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。處死裸鼠,分別取出對照組、3,6-DHF(20mg/kg)組和未進行任何處理的裸鼠肺組織,HE染色結(jié)果顯示對照組裸鼠肺組織出現(xiàn)明顯的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié),未進行任何處理的裸鼠肺組織和未發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的裸鼠肺組織中均未發(fā)現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。3.Notch信號通路在3,6-DHF抑制乳腺癌細(xì)胞EMT中的作用(1)WB結(jié)果顯示乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞中,隨3,6-DHF濃度的增加,Notch信號通路相關(guān)蛋白Notch1、NICD、Hes-1和c-Myc的表達逐漸下降。同樣,免疫熒光結(jié)果顯示隨3,6-DHF濃度的增加,MDA-MB-231細(xì)胞中Notch1和Hes-1的表達逐漸降低。免疫共沉淀實驗(co-immunoprecipitation,CO-IP)和WB結(jié)果顯示,當(dāng)IP蛋白分別為CSL和MAML時,隨3,6-DHF濃度升高,NICD表達逐漸降低。WB結(jié)果顯示3,6-DHF(20mg/kg)組移植瘤中Notch通路相關(guān)蛋白Notch1和NICD表達明顯低于對照組移植瘤。同樣,免疫組化實驗結(jié)果顯示3,6-DHF(20mg/kg)處理組移植瘤中Notch1、NICD和Hes-1的表達低于對照組。(2)MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-Notch1質(zhì)粒(TCNotch1)或轉(zhuǎn)染anti-mi R-34a寡核苷酸(TCanti-34a),WB結(jié)果顯示20μM 3,6-DHF作用TCNotch1和TCanti-34a細(xì)胞不能降低Notch1和NICD的蛋白表達水平。在TCNotch1和TCanti-34a細(xì)胞中,Notch1過表達可降低3,6-DHF對EMT標(biāo)志蛋白Snail、Twist和Slug的抑制效應(yīng),減弱3,6-DHF對E-cadherin蛋白的上調(diào)作用。同樣,mi R-34a沉默也可以減輕3,6-DHF對Snail、Twist和Slug蛋白的下調(diào)作用,降低3,6-DHF對E-cadherin蛋白的上調(diào)作用。Transwell侵襲和遷移實驗結(jié)果顯示3,6-DHF作用于TCNotch1和TCanti-34a細(xì)胞降低兩種細(xì)胞穿過小室的數(shù)量,但是仍明顯高于UTC細(xì)胞。ALDEFLOUR○R分析結(jié)果顯示3,6-DHF可抑制UTC細(xì)胞中ALDH+細(xì)胞的比例,3,6-DHF處理也可降低TCNotch1和TCanti-34a細(xì)胞中ALDH+細(xì)胞的比例,但仍高于UTC細(xì)胞中ALDH+細(xì)胞的比例。微球體成球?qū)嶒灲Y(jié)果顯示3,6-DHF降低UTC細(xì)胞、TCNotch1和TCanti-34a細(xì)胞中微球體的數(shù)量,但TCNotch1和TCanti-34a細(xì)胞成球數(shù)量仍明顯高于UTC細(xì)胞。主要結(jié)論:(1)3,6-DHF可在體內(nèi)外對乳腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生和BCSCs的形成具有顯著的抑制效應(yīng)。(2)3,6-DHF可從體內(nèi)外顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。(3)3,6-DHF能顯著抑制Notch信號通路相關(guān)蛋白的表達及NICD-CSL-MAML轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的結(jié)合,進而抑制Notch信號通路;而采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達Notch基因或si RNA沉默mi R-34a表達后,3,6-DHF對乳腺癌細(xì)胞EMT的抑制效應(yīng)被顯著抑制。表明Notch信號通路在3,6-DHF抑制乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT中發(fā)揮了重要的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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