發(fā)布時(shí)間：2018-03-08 18:42

  本文選題：p53　切入點(diǎn)：鋅　出處：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：前列腺癌病人多好發(fā)于60歲以上的老年人,轉(zhuǎn)移率高而且發(fā)現(xiàn)就已是晚期,所以化學(xué)治療是治療前列腺癌的主要方法。大約有一半以上的前列腺癌患者中存在p53突變或者失活,p53的狀態(tài)決定了化療藥物對(duì)于前列腺癌的敏感性;前列腺癌中鋅的濃度要比正常的前列腺組織低很多,我們推測(cè)前列腺癌中鋅濃度降低有可能與p53功能喪失和化療抵抗有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)涉及兩方面的內(nèi)容,先通過(guò)外源補(bǔ)充鋅來(lái)探討鋅是否增強(qiáng)前列腺癌PC-3細(xì)胞對(duì)于化療藥物紫杉醇的敏感性,接著又在細(xì)胞中導(dǎo)入了一種表達(dá)野生型p53與抑制MDM2的共表達(dá)質(zhì)粒Pmp53,探討鋅對(duì)外源性p53穩(wěn)定性的影響。[目的]1.在前列腺癌PC-3細(xì)胞系中補(bǔ)充微量元素鋅,研究鋅是否能增強(qiáng)紫杉醇的化療敏感性;2.在細(xì)胞中導(dǎo)入Pmp53,研究鋅對(duì)細(xì)胞內(nèi)外源性p53穩(wěn)定性的影響。[方法]一、鋅對(duì)PC-3細(xì)胞內(nèi)紫杉醇化療敏感性的影響實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組,鋅組,紫杉醇組,鋅+紫杉醇組。MTT方法確定PC-3細(xì)胞中鋅聯(lián)合紫杉醇的最佳濃度,形態(tài)學(xué)分析鋅聯(lián)合紫杉醇對(duì)于細(xì)胞形態(tài)的影響,克隆形成實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞的增殖能力,免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞凋亡及增殖能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組的凋亡情況及線粒體膜電勢(shì)的高低,PCR以及Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bax,Bcl-2,Cleaved-caspase3,Cleaved-caspase9及MDM2等凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平的變化。二、鋅對(duì)外源性p53穩(wěn)定性的影響在PC-3細(xì)胞中導(dǎo)入一種表達(dá)野生型p53及抑制MDM2的共表達(dá)質(zhì)粒Pmp53,實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照(Control)組,鋅(Zn)組,Pmp53組,Pmp53+Zn組,TPEN組,Pmp53+TPEN組,Pmp53+Zn+TPEN組。PCR以及Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組p53及MDM2基因及蛋白水平的變化,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p53與MDM2的結(jié)合能力,環(huán)己酰亞胺(CHX)捕獲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDM2以及p53的半衰期。[結(jié)果]一、鋅增強(qiáng)PC-3細(xì)胞的化療敏感性1)MTT結(jié)果顯示10nmol/L紫杉醇聯(lián)合250μmol/L鋅能夠明顯抑制PC-3細(xì)胞的增殖(P0.05)。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)及免疫熒光KI-67染色觀察到與對(duì)照組、鋅組、紫杉醇組相比,鋅聯(lián)合紫杉醇組能夠明顯抑制細(xì)胞的增殖能力(P0.05);Annexin V-FITC流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光Hochest染色發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組、鋅組、紫杉醇組相比,鋅聯(lián)合紫杉醇組能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡(P0.05);JC-1染色發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組、鋅組、紫杉醇組相比,鋅聯(lián)合紫杉醇組能夠明顯降低細(xì)胞內(nèi)線粒體的膜電位(P0.05)。2)RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組、鋅組、紫杉醇組相比,鋅聯(lián)合紫杉醇組能夠明顯降低細(xì)胞內(nèi)Bcl-2及MDM2的基因表達(dá)水平,能夠明顯增強(qiáng)Bax、caspase3及caspase9的基因表達(dá)水平(P0.05)。Western-blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組、鋅組、紫杉醇組相比,鋅聯(lián)合紫杉醇組能夠明顯降低細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的蛋白表達(dá)水平、及原癌基因MDM2的蛋白表達(dá)水平;能夠明顯增強(qiáng)Bax、Cleaved-caspase3及Cleaved-caspase9的蛋白表達(dá)水平。(P0.05)。二、鋅增強(qiáng)了外源性p53的穩(wěn)定性PCR以及Western-blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與Pmp53組相比,Pmp53+Zn組中p53的m RNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化,p53的蛋白表達(dá)水平明顯增強(qiáng),也就是說(shuō)鋅可能穩(wěn)定了p53蛋白的翻譯后修飾方式。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與Pmp53組相比,Pmp53+Zn組中與MDM2結(jié)合的p53蛋白表達(dá)量明顯降低,與Pmp53+Zn組相比,Zn+Pmp53+TPEN組與MDM2結(jié)合的p53的蛋白表達(dá)量明顯增高;說(shuō)明加入鋅之后p53與MDM2的結(jié)合能力明顯降低,MDM2對(duì)p53的泛素化降解水平減弱,也就是說(shuō)鋅穩(wěn)定了p53蛋白的表達(dá)水平。環(huán)己酰亞胺捕獲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與Pmp53組相比,Pmp53+Zn組p53的半衰期明顯延長(zhǎng),也進(jìn)一步說(shuō)明鋅穩(wěn)定了p53蛋白的表達(dá)。[結(jié)論]1.鋅聯(lián)合紫杉醇能夠明顯抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。說(shuō)明鋅增強(qiáng)了PC-3細(xì)胞對(duì)于紫杉醇的化療敏感性。2.鋅降低了MDM2對(duì)于外源性p53的泛素化降解,延長(zhǎng)了p53的半衰期。說(shuō)明鋅可增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)外源性p53的穩(wěn)定性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.25

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本文編號(hào)：1585100