本文選題：黑色素瘤　切入點(diǎn)：GADD45A　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:黑色素瘤是一種皮膚惡性腫瘤,其早期不易發(fā)現(xiàn),晚期極易轉(zhuǎn)移,并且具有極高的化療耐藥性。目前,癌癥治療最有效的手段是手術(shù)、放療、化療和免疫治療�；熓且环N全身治療的手段,通過靜脈給藥途徑,化學(xué)藥物會(huì)隨著血液循環(huán)遍布全身的絕大部分器官和組織。因此,高轉(zhuǎn)移性的惡性黑色素瘤的主要治療手段是化療。順鉑是一種治療癌癥常用的鉑類化療藥物,能夠造成細(xì)胞DNA損傷,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞生長增殖,從而殺傷癌細(xì)胞。但是腫瘤細(xì)胞通過抑制藥物的攝取以及增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)功能,產(chǎn)生化療耐藥。針對(duì)化療耐藥的DNA損傷修復(fù)機(jī)制尚不明確,發(fā)現(xiàn)新型有效的作用靶點(diǎn)對(duì)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞化療敏感性具有重要意義。GADD45A(Growth Arrest and DNA damage-inducible 45 A)是DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵基因,在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。通常在損傷因子作用后,GADD45A隨著DNA損傷修復(fù)通路的誘導(dǎo)而產(chǎn)生。因此,GADD45A基因在腫瘤細(xì)胞耐藥中起著重要的作用。目的:該研究主要通過下調(diào)DNA損傷修復(fù)基因GADD45A的表達(dá),研究其在黑色素瘤化療耐藥中的作用機(jī)制,能夠作為新的作用靶點(diǎn)增強(qiáng)黑色素瘤化療敏感性,從而達(dá)到治愈的效果。方法:1.利用qPCR array檢測(cè)在順鉑作用下的黑色素瘤A375細(xì)胞中的84種DNA損傷修復(fù)基因的m RNA表達(dá)情況。2.根據(jù)目的基因GADD45A的堿基序列,設(shè)計(jì)特異的si RNA及無關(guān)(negative control)干擾序列。利用小RNA干擾技術(shù),通過lipofectamin2000脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞,獲得GADD45A表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞模型。3.q PCR和Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞中目的基因的m RNA及蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況。4.采用MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體外培養(yǎng)的A375細(xì)胞的生長和增殖情況。5.細(xì)胞流式法檢測(cè)細(xì)胞的周期和凋亡變化情況。6.利用彗星實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)A375細(xì)胞在順鉑作用下,細(xì)胞DNA損傷和DNA損傷相關(guān)蛋白γH2AX的表達(dá)情況。結(jié)果:1.PCR array結(jié)果表明,順鉑作用于A375細(xì)胞后,84種DNA損傷修復(fù)基因中有12種基因表達(dá)水平升高兩倍以上,其中GADD45A基因m RNA表達(dá)水平升高5倍以上。2.q PCR和Western Blot結(jié)果驗(yàn)證了GADD45A基因的表達(dá)水平受順鉑的誘導(dǎo)作用明顯升高,并且具有濃度和時(shí)間依賴性。3.利用小RNA干擾技術(shù),成功獲得GADD45A表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞模型。4.MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,GADD45A表達(dá)下調(diào)組細(xì)胞受順鉑藥物的生長和增殖抑制作用明顯高于對(duì)照組細(xì)胞。5.細(xì)胞流式結(jié)果表明,GADD45A表達(dá)下調(diào)組細(xì)胞受順鉑藥物的凋亡誘導(dǎo)作用明顯高于對(duì)照組細(xì)胞,并且與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)有關(guān)。6.彗星實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果表明,GADD45A表達(dá)下調(diào)組細(xì)胞受順鉑藥物的DNA損傷誘導(dǎo)作用明顯高于對(duì)照組細(xì)胞,說明GADD45A基因表達(dá)下調(diào)能夠增強(qiáng)黑色素瘤細(xì)胞的化療敏感性。7.Western Blot結(jié)果顯示MEK抑制劑影響GADD45A的表達(dá),說明MAPK信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)GADD45A的表達(dá)。結(jié)論:GADD45A基因表達(dá)下調(diào)能夠明顯增強(qiáng)黑色素瘤細(xì)胞的化療敏感性,說明該基因在誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生化療耐藥性中起著至關(guān)重要的作用,并且GADD45A基因有望成為新的分子作用靶點(diǎn),成為降低惡性黑色素瘤耐藥性的有效作用靶點(diǎn)。
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本文編號(hào)：1575715