本文選題：黑色素瘤　切入點：GADD45A　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:黑色素瘤是一種皮膚惡性腫瘤,其早期不易發(fā)現(xiàn),晚期極易轉(zhuǎn)移,并且具有極高的化療耐藥性。目前,癌癥治療最有效的手段是手術(shù)、放療、化療和免疫治療�；熓且环N全身治療的手段,通過靜脈給藥途徑,化學(xué)藥物會隨著血液循環(huán)遍布全身的絕大部分器官和組織。因此,高轉(zhuǎn)移性的惡性黑色素瘤的主要治療手段是化療。順鉑是一種治療癌癥常用的鉑類化療藥物,能夠造成細胞DNA損傷,誘導(dǎo)細胞凋亡,抑制細胞生長增殖,從而殺傷癌細胞。但是腫瘤細胞通過抑制藥物的攝取以及增強DNA損傷修復(fù)功能,產(chǎn)生化療耐藥。針對化療耐藥的DNA損傷修復(fù)機制尚不明確,發(fā)現(xiàn)新型有效的作用靶點對增強腫瘤細胞化療敏感性具有重要意義。GADD45A(Growth Arrest and DNA damage-inducible 45 A)是DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵基因,在細胞凋亡和細胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。通常在損傷因子作用后,GADD45A隨著DNA損傷修復(fù)通路的誘導(dǎo)而產(chǎn)生。因此,GADD45A基因在腫瘤細胞耐藥中起著重要的作用。目的:該研究主要通過下調(diào)DNA損傷修復(fù)基因GADD45A的表達,研究其在黑色素瘤化療耐藥中的作用機制,能夠作為新的作用靶點增強黑色素瘤化療敏感性,從而達到治愈的效果。方法:1.利用qPCR array檢測在順鉑作用下的黑色素瘤A375細胞中的84種DNA損傷修復(fù)基因的m RNA表達情況。2.根據(jù)目的基因GADD45A的堿基序列,設(shè)計特異的si RNA及無關(guān)(negative control)干擾序列。利用小RNA干擾技術(shù),通過lipofectamin2000脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染A375細胞,獲得GADD45A表達下調(diào)的細胞模型。3.q PCR和Western Blot方法檢測細胞中目的基因的m RNA及蛋白質(zhì)水平的表達情況。4.采用MTT法和克隆形成實驗檢測體外培養(yǎng)的A375細胞的生長和增殖情況。5.細胞流式法檢測細胞的周期和凋亡變化情況。6.利用彗星實驗和細胞免疫熒光檢測A375細胞在順鉑作用下,細胞DNA損傷和DNA損傷相關(guān)蛋白γH2AX的表達情況。結(jié)果:1.PCR array結(jié)果表明,順鉑作用于A375細胞后,84種DNA損傷修復(fù)基因中有12種基因表達水平升高兩倍以上,其中GADD45A基因m RNA表達水平升高5倍以上。2.q PCR和Western Blot結(jié)果驗證了GADD45A基因的表達水平受順鉑的誘導(dǎo)作用明顯升高,并且具有濃度和時間依賴性。3.利用小RNA干擾技術(shù),成功獲得GADD45A表達下調(diào)的細胞模型。4.MTT法和克隆形成實驗結(jié)果表明,GADD45A表達下調(diào)組細胞受順鉑藥物的生長和增殖抑制作用明顯高于對照組細胞。5.細胞流式結(jié)果表明,GADD45A表達下調(diào)組細胞受順鉑藥物的凋亡誘導(dǎo)作用明顯高于對照組細胞,并且與細胞周期的調(diào)節(jié)有關(guān)。6.彗星實驗和細胞免疫熒光結(jié)果表明,GADD45A表達下調(diào)組細胞受順鉑藥物的DNA損傷誘導(dǎo)作用明顯高于對照組細胞,說明GADD45A基因表達下調(diào)能夠增強黑色素瘤細胞的化療敏感性。7.Western Blot結(jié)果顯示MEK抑制劑影響GADD45A的表達,說明MAPK信號通路參與調(diào)節(jié)GADD45A的表達。結(jié)論:GADD45A基因表達下調(diào)能夠明顯增強黑色素瘤細胞的化療敏感性,說明該基因在誘導(dǎo)黑色素瘤細胞產(chǎn)生化療耐藥性中起著至關(guān)重要的作用,并且GADD45A基因有望成為新的分子作用靶點,成為降低惡性黑色素瘤耐藥性的有效作用靶點。
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本文編號：1575715