本文選題：腫瘤相關成纖維細胞　切入點：肝星狀細胞　出處：《南京醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:本研究將三株不同侵襲性的肝癌細胞SMMC-7721、BEL-7402、HepG2分別與肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)LX2細胞transwell共培養(yǎng),論證肝癌微環(huán)境中 TGFβ1(transforming growth factor betal,TGFβ1)可以促進 LX2 細胞向腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)轉化,LX2細胞轉化為CAFs后促進肝癌細胞發(fā)生上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),最終促進肝癌細胞的侵襲和遷移。研究結果將為探討HSCs以及TGFβ1對肝癌細胞侵襲遷移的影響提供實驗依據(jù),并為尋找肝癌治療新靶標提供方向。方法：①LX2細胞與肝癌細胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)分別共培養(yǎng),觀察LX2細胞形態(tài)變化。用TGFβ1刺激LX2細胞,觀察LX2細胞形態(tài)改變。②不同濃度的TGFβ1及其抑制劑SB525334處理單獨培養(yǎng)以及與肝癌細胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)共培養(yǎng)的 LX2 細胞,RT-PCR 檢測 CAFs相關分子α-SMA、FAP、Desmin等mRNA表達水平的變化;Westerm Blot檢測α-SMA、FAP、Desmin蛋白表達水平的變化;③不同濃度TGF[β1及其抑制劑處理單獨培養(yǎng)以及與LX2細胞共培養(yǎng)的肝癌細胞BEL-7402,Transwell遷移實驗及侵襲實驗檢測單獨培養(yǎng)和與LX2細胞共培養(yǎng)的肝癌細胞BEL-7402遷移侵襲能力的變化;④不同濃度TGFβ1及其抑制劑處理單獨培養(yǎng)和與LX2細胞共培養(yǎng)的肝癌細胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2),實時定量 RT-PCR 檢測肝癌細胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)EMT相關分子E-cadherin、vimentin等 mRNA表達水平的變化;Western Blot檢測E-cadherin、Vimentin蛋白表達水平的變化;⑤不同濃度TGFβl及其抑制劑處理單獨培養(yǎng)和與LX2細胞共培養(yǎng)的肝癌細胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2),實時定量 RT-PCR 檢測肝癌細胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)中侵襲轉移相關分子 EGF、VEGF、MMPs mRNA表達水平的變化;Western Blot檢測MMP2、VEGF蛋白表達水平的變化。結果:①LX2細胞與肝癌細胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)分別共培養(yǎng)48h或者TGFβ1刺激后,其形態(tài)發(fā)生變化,由星形或多邊形轉變?yōu)榧忓N形、扁平長梭形,細胞呈兩極生長,細胞突觸明顯減少;②LX2細胞與肝癌細胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)分別共培養(yǎng)48 h后,在mRNA水平,其CAFs相關分子α-SMA或FAP的表達顯著升高。不同濃度TGFβ1及其抑制劑處理單獨培養(yǎng)以及與肝癌細胞共培養(yǎng)的LX2后,TGFβ1可以顯著促進α-SMA、FAP在基因水平的表達,其效應可以被TGFβ1抑制劑所取消;在蛋白水平,TGFβ1可以顯著促進α-SMA、Desmin、FAP的表達,抑制劑可以取消TGFβ1的作用;③與LX2細胞共培養(yǎng)后,BEL-7402細胞的遷移和侵襲能力顯著增加,不同濃度TGFβ1及其抑制劑處理后,結果顯示TGFβ1可以顯著提高BEL-7402細胞的遷移和侵襲能力,TGFβ1的抑制劑可以取消上述效應;④與LX2細胞共培養(yǎng)后,在mRNA水平,肝癌細胞SMMC-7721上皮標志物E-Cadherin的表達顯著降低,間質標志物N-Cadherin、Vimentin的表達顯著升高,調控EMT過程的轉錄因子Twist的表達顯著升高,BEL-7402及HepG2間質標志物fibronectin表達升高。不同濃度TGFβ1及其抑制劑處理肝癌細胞SMMC-7721后,TGFβ1可以抑制E-Cadherin的表達,顯著促進Vimentin的表達,抑制劑可以取消TGFβ1的作用;在蛋白水平,肝癌細胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)與 LX2 細胞共培養(yǎng)后,E-Cadherin 的表達降低,Vimentin的表達顯著升高。不同濃度TGFβ1及其抑制劑處理單獨培養(yǎng)以及與LX2共培養(yǎng)的肝癌細胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)后,TGFβ1 可以抑制 E-Cadherin的表達,顯著促進Vimentin的表達,抑制劑可以取消TGFβ1的作用。⑤與LX2細胞分別共培養(yǎng)后,在mRNA水平,三株肝癌細胞侵襲轉移相關分子發(fā)生變化;SMMC-7721 細胞中 EGF、VEGF、MMP1、MMP2、MMP9、MMP13的表達顯著升高,BEL-7402細胞MMP1、MMP2、MMP9表達顯著升高,HepG2細胞VEGF、MMP1表達顯著增高;在蛋白水平,SMMC-7721細胞中MMP2的表達顯著升高,BEL-7402、HepG2細胞中MMP2、VEGF表達顯著增高。不同濃度TGFβ1及其抑制劑處理單獨培養(yǎng)以及與LX2共培養(yǎng)的肝癌細胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)后,在 mRNA 水平,TGFβ1 可以顯著上調SMMC-7721細胞MMP2、VEGF的表達,且共培養(yǎng)體系中升高的更為明顯,TGFβ1的作用可以被其抑制劑取消;在蛋白水平,TGFβ1可以顯著促進三株肝癌細胞MMP2、VEGF的表達,抑制劑可以取消TGFβ1的上述作用。結論:①在肝癌微環(huán)境中,TGFβ1能夠促進HSCs向CAFs轉化。②HSCs向CAFs轉化可促進肝癌細胞的EMT過程,從而促進肝癌細胞的侵襲轉移。③實驗結果為研究間質細胞在肝癌侵襲轉移中的作用提供實驗依據(jù)。
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【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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本文編號：1575418