發(fā)布時間：2018-03-04 04:36

  本文選題：垂體腺瘤　切入點：PTEN基因　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：垂體腺瘤(pituitary adenoma)是一種常見的顱內(nèi)腫瘤,約占顱內(nèi)腫瘤的10%,發(fā)病率僅次于腦膠質(zhì)瘤和腦膜瘤,居顱內(nèi)腫瘤第三位。侵襲性垂體腺瘤是一種界于良惡性之間的腫瘤,有著侵襲性生長的生物學(xué)行為,當(dāng)其侵入海綿竇累及頸內(nèi)動脈、顱神經(jīng)、硬腦膜等結(jié)構(gòu),即稱其為侵襲性垂體腺瘤。侵襲性垂體腺瘤臨床進(jìn)展迅速,發(fā)現(xiàn)時腫瘤體積較大,往往伴有卒中、壞死,加以顱底結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,又有多種神經(jīng)和血管穿行,因此手術(shù)難度高、手術(shù)風(fēng)險相對較大,同時又由于侵襲性垂體腺瘤生長方式、侵襲海綿竇等部位導(dǎo)致手術(shù)顯露困難,術(shù)后腫瘤殘留率高。這些原因?qū)е虑忠u性垂體腺瘤的復(fù)發(fā)率極高,臨床療效較差,其治療效果一直困擾著臨床醫(yī)生,給患者帶來了極大的痛苦。隨著分子生物學(xué)技術(shù)日新月異的發(fā)展,對垂體腺瘤發(fā)病機(jī)制的研究最近也有很大的進(jìn)展,但是對于垂體腺瘤侵襲性的具體機(jī)制依然不十分明確,因此有必要進(jìn)一步研究垂體腺瘤的侵襲機(jī)制,以期尋找治療侵襲性垂體腺瘤的靶基因,提供新型的侵襲性垂體腺瘤診斷、治療方案及理論學(xué)基礎(chǔ),以減少垂體腺瘤的復(fù)發(fā)。PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10, PTEN)于1997年被發(fā)現(xiàn),是一種抑癌基因,是第十號染色體上缺失的磷酸酶與張力蛋白同源基因。Hollander等研究顯示,它在人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用,它位于人類染色體的10q23.3,由九個外顯子所組成,是一個腫瘤抑制基因,顯示雙重特異性磷酸酶活性。PTEN能夠通過調(diào)控多種腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移等方式,對腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移有抑制作用,PTEN能夠穩(wěn)定并提高腫瘤細(xì)胞間的黏附能力,抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解和腫瘤血管生成、并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,從而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。突變的PTEN基因與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。PTEN發(fā)生缺失和突變在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起著同樣重要的作用,Kato等研究表明,PTEN基因在大多數(shù)膠質(zhì)瘤中都表現(xiàn)出缺損,這在晚期的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中更為明顯,能夠達(dá)到60%-80%之多；在膠質(zhì)瘤惡性改變的過程中,PTEN表達(dá)下調(diào)或缺失起著非常重要的作用。Idoate等人發(fā)現(xiàn),PTEN基因雜和性缺失的頻率能夠隨著膠質(zhì)瘤級別增加而增加。大量研究證實,PTEN基因的突變或缺失與乳腺癌食管癌,前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展有著十分密切的聯(lián)系,腫瘤的惡性程度越高,PTEN的表達(dá)率越低。目前,基因缺失在垂體瘤的發(fā)病中的作用及機(jī)制的報道不多,抑癌基因發(fā)生突變與垂體腺瘤病程中的發(fā)生發(fā)展過程有一定的關(guān)系,因此PTEN的突變很可能與垂體腺瘤的侵襲力存在一定的相關(guān)性,但是目前的研究報道較為罕見,有待進(jìn)一步明確。冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(cold inducible RNA binding protein, CIRP)屬于一種新型的RNA結(jié)合蛋白,在人類位列于第19染色體p13.3的位點上。人們對第19號染色體進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn),其中定位的基因超過1500個,是最高的基因密度的染色體,自然雜志于2004年發(fā)表了其基因的全序列。在第19號染色體上,有著特殊的特點,不僅G+C的含量較高,而且所有基因的重排率也非常高,并且同樣有著很高的復(fù)制率,這些特點也能說明它的活躍度很高,在生物體進(jìn)化過程中有著十分重要的意義。在對遺傳疾病進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn),很多這類基因都參與了其中。人體如果受到了外界的各種環(huán)境的污染,甚至受到了輻射污染,對被污染后損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)的基因也是位列于第19號染色體上。CIRP基因在人體的多種細(xì)胞上以及在大鼠的內(nèi)臟組織都有表達(dá),如果機(jī)體發(fā)生了應(yīng)激,在不同部位上的CIRP基因的表達(dá)會出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)的變化。CIRP一類基因?qū)C(jī)體生理活性調(diào)節(jié)有著非常重要的作用,CIRP基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄后能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。研究顯示,基因的轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控,對組織細(xì)胞的生長、增殖與分化都有著密切的調(diào)節(jié)作用,這種作用機(jī)制對多種基因的表達(dá)以及基因所表達(dá)的部位是否發(fā)生了異常都有著密切的調(diào)控作用,并最終對組織細(xì)胞發(fā)展分化方向進(jìn)行影響。最近的研究表明,CIRP有著癌基因的特性,Guo X等研究表明CIRP能夠引起人抗原R和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白E1出現(xiàn)異常的表達(dá),這些異常的改變與乳腺癌發(fā)病密切相關(guān),Zeng發(fā)現(xiàn)當(dāng)CIRP蛋白活性被抑制后能夠降低前列腺癌細(xì)胞的增殖能力,將CIRP基因沉默后可以促使腫瘤細(xì)胞死亡,存活率降低,并且能夠令腫瘤細(xì)胞在化療過程中對藥物的敏感性提高。并且有研究顯示,在不同的細(xì)胞系中,如HeLa.TERA2等細(xì)胞,CIRP基因的表達(dá)會導(dǎo)致這類細(xì)胞的生長發(fā)生抑制,由此推測,在腫瘤的治療當(dāng)中,CIRP也許是一個新的潛在的作用靶點。在腫瘤的發(fā)生以及細(xì)胞生長過程的轉(zhuǎn)化中,基因翻譯水平發(fā)生了突變時會對其有著深入的影響,CIRP在目前的研究中,發(fā)現(xiàn)它通過與翻譯元件發(fā)生相互作用,使得mRNA的翻譯獲得了促進(jìn),令特定的蛋白的合成發(fā)生了加速,細(xì)胞增殖率提高。但目前為止,這些改變的調(diào)控機(jī)制仍不明確。Wang M等研究表明,CIRP基因與垂體腺瘤復(fù)發(fā)增殖密切相關(guān),但由于樣本量小,CIRP與垂體腺瘤侵襲性的關(guān)系是需要進(jìn)一步研究的相關(guān)。目的：PTEN和CIRP表達(dá)改變與垂體腺瘤侵襲性的關(guān)系,目前研究報道較少。本實驗對復(fù)發(fā)垂體腺瘤、侵襲性垂體腺瘤、非侵襲性垂體腺瘤組織中PTEN和CIRP的表達(dá)情況進(jìn)行研究,分析其相關(guān)性。并與臨床資料相結(jié)合,研究他們在不同組織的表達(dá)情況及相關(guān)機(jī)制。對垂體腺瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中可能存在的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行探討,從而為垂體腺瘤的診斷和治療提供新的實驗理論支持。方法1.選擇2014年1月到2016年1月間來臨沂市人民醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的垂體腺瘤新鮮標(biāo)本60例,其中20例為復(fù)發(fā)垂體腺瘤。垂體腺瘤新鮮標(biāo)本通過影像學(xué)提示,使用了Hardy-Wilson與Knosp的方法進(jìn)行分級,將其中的Ⅲ級以上或者是C期以上的垂體腫瘤劃分為侵襲性組別,其他則歸為非侵襲性組別,每組為20例患者。在研究過程中,所有納入研究的患者均自愿簽署知情同意書。手術(shù)過程中所獲得的病理標(biāo)本,分為兩部分,一小部分用作原代細(xì)胞培養(yǎng),另外一部分則通過液氮保持,以做后續(xù)實驗。2.運用轉(zhuǎn)染技術(shù),結(jié)合劃痕實驗、western blo、real-time PCR及免疫組化在大體水平及細(xì)胞水平探討PTEN與CIRP在垂體腺瘤中的作用及相關(guān)機(jī)制。結(jié)果1.非侵襲性垂體腺瘤PTEN無論是在免疫組化、western blot及PCR的檢測中均為最高,在侵襲性垂體腺瘤次之,而復(fù)發(fā)性垂體腺瘤則是最低,它們之間比較有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。CIRP蛋白表達(dá)則是相反。由此推測,PTEN有抑制腫瘤發(fā)展的作用,而CIRP則是促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。2.轉(zhuǎn)染了PTEN的細(xì)胞增殖較其余幾組慢,而轉(zhuǎn)染了CIRP組則有顯著的細(xì)胞增殖情況,兩組比較有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。同時采用了熒光顯微鏡進(jìn)行了驗證,結(jié)果與上述相同。轉(zhuǎn)染了PTEN的細(xì)胞侵襲能力較其余幾組明顯降低,而轉(zhuǎn)染了CIRP組則細(xì)胞侵襲力情況明顯增強(qiáng),兩組比較有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。3.基質(zhì)金屬蛋白酶能降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的大部分成分,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力,本部分研究中探討了MMP-2與MMP-9在兩基因干預(yù)后的蛋白表達(dá)變化,結(jié)果顯示MMP-2與MMP-9在PTEN轉(zhuǎn)染組中,與對照組比較有明顯的降低,兩者有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異；而在CIRP轉(zhuǎn)染組中,與對照組比較有升高趨勢,并且MMP-2的蛋白表達(dá)升高更為明顯,兩者有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。4.用western blot方法檢測各干預(yù)組的凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-7及caspase-9的表達(dá),從各轉(zhuǎn)染組對GH3細(xì)胞干預(yù)后檢測凋亡相關(guān)基因發(fā)現(xiàn),PTEN細(xì)胞凋亡最為明顯,而CIRP的細(xì)胞凋亡情況則是顯著低于PTEN組,兩者比較有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。同樣方法檢測各干預(yù)組的p-AKT的表達(dá),從各轉(zhuǎn)染組對GH3細(xì)胞干預(yù)后檢測p-AKT水平時發(fā)現(xiàn),PTEN能夠抑制AKT信號通路的活化,而CIRP則是促進(jìn)AKT信號通路的活化。我們使用P13K抑制劑LY294002對PI3K/AKT信號通路進(jìn)行阻斷后,再采用上述相同方法干預(yù),再次探討AKT通路的活化情況,結(jié)果顯示,使用P13K抑制劑后,能夠遏制了CIRP轉(zhuǎn)染組的AKT活化作用,而其余各種變化不明顯。結(jié)論1.在垂體腺瘤中,非侵襲性垂體腺瘤PTEN表達(dá)表達(dá)最高,侵襲性垂體腺瘤次之,復(fù)發(fā)垂體腺瘤最低,而CIRP表達(dá)則與之相反。由此推測,PTEN有抑制腫瘤發(fā)展的作用,而CIRP則與垂體腺瘤侵襲性和復(fù)發(fā)有關(guān)。2. PTEN與CIRP表達(dá)平衡破壞,促使垂體腺瘤侵襲力增加。3. PTEN與CIRP表達(dá)平衡破壞,通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路,從而調(diào)節(jié)垂體腺瘤細(xì)胞的凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R736.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1564181