本文選題：PLAC8　切入點(diǎn)：肝癌　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：[背景及目的]在世界范圍內(nèi),肝癌仍然是癌癥致死的主要原因之一,是第三大致死性癌癥,每年的死亡數(shù)高達(dá)100萬(wàn)。近些年來(lái),雖然肝癌的臨床研究取得了很大的進(jìn)展,但肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制目前還尚不完全清楚。隨著對(duì)肝癌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞內(nèi)部的某些轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活或抑制與肝癌的發(fā)生、發(fā)展等有著緊密的聯(lián)系。通過對(duì)癌癥信號(hào)通路的抑制治療癌癥是近年來(lái)腫瘤臨床治療方面的重大突破。應(yīng)用siRNA沉默β-catenin基因及蛋白質(zhì)的表達(dá),并使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。一次轉(zhuǎn)染可在一定時(shí)間內(nèi)抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng),在肝癌的治療中起一定的作用,但不能治愈肝癌。肝癌細(xì)胞中β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路可以調(diào)節(jié)肝癌的細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、血管生成因子、端粒酶及其它信號(hào)通路等,因此抑制β-catenin信號(hào)通路在肝癌的治療中起一定的作用。胎盤特異蛋白8 (PLAC8),又稱為onzin8,富含半胱氨酸蛋白,在人類的樹突狀細(xì)胞中首次被發(fā)現(xiàn)。PLAC8基因大小近700 bp,其開放閱讀框的長(zhǎng)度約348 bp,但一些RNA印跡表明在某些器官中其]mRNA長(zhǎng)度為4400-7000 bp。PLAC8蛋白分子質(zhì)量為12.4 kDa,在一些哺乳動(dòng)物中其信號(hào)肽的限制酶結(jié)合位點(diǎn)具有相似性,并且氨基酸序列中富含占據(jù)10%總長(zhǎng)的半胱氨酸,比如,在全長(zhǎng)的人PLAC8中,每112個(gè)氨基酸就包含15個(gè)半胱氨酸；在全長(zhǎng)的鼠PLAC8中每115個(gè)氨基酸包含16個(gè)半胱氨酸。大部分的半胱氨酸形成CXXC結(jié)構(gòu),形成分子內(nèi)部的二硫鍵,該結(jié)構(gòu)是結(jié)合其底物的特殊位點(diǎn)�；蚪M分析表明人PLAC8基因位于染色體4q13-4q21,包含由U2 GT-AG連接的5個(gè)外顯子。它參與調(diào)控癌癥,細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞的分化過程。相關(guān)報(bào)道指出PLAC8是肝癌發(fā)生的標(biāo)記物,但是它在癌癥早期高表達(dá),之后其表達(dá)水平又逐漸降低。但PLAC8在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的研究較少,其對(duì)肝癌發(fā)生到底起抑制作用還是促進(jìn)作用仍不明確；在癌癥中,其具體的作用機(jī)制也未見報(bào)道,同時(shí),調(diào)控PLAC8表達(dá)的相關(guān)因子也尚未加以研究。本課題旨在檢測(cè)PLAC8在肝癌發(fā)生過程中的表達(dá),并探討其作用機(jī)制,為HCC分子機(jī)制的探究尋找新的依據(jù)。[方法]一, PLAC8在肝癌中的表達(dá)1.肝癌病人肝臟同正常肝臟的PLAC8表達(dá)水平檢測(cè)分別提取肝癌病人肝臟和正常肝臟中的RNA,通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)PLAC8的mRNA表達(dá)情況。2.肝癌病人肝腫瘤周圍組織和腫瘤組織中PLAC8的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)分別提取肝癌患者肝腫瘤周圍組織和腫瘤組織中的RNA,通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)PLAC8的mRNA表達(dá)情況。3.肝癌病人肝腫瘤周圍組織和腫瘤組織中PLAC8的蛋白水平檢測(cè)對(duì)136例肝癌病人的肝腫瘤周圍組織和腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,檢測(cè)PLAC8蛋白水平的變化情況。4. PLAC8水平對(duì)肝癌患者生存率的影響對(duì)136例肝癌患者的生存時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并對(duì)PLAC8水平的高低和生存時(shí)間作圖。二、PLAC8對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響Huh7細(xì)胞過表達(dá)PLAC8原位接種構(gòu)建腫瘤模型將過表達(dá)PLAC8的Huh7細(xì)胞或空載體細(xì)胞以1×106/只注射至雌性BALB/c (nu/nu)小鼠肝臟中,4周后處死小鼠,取出肝臟拍照并對(duì)腫瘤體積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。三、PLAC8對(duì)肝腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響1.PLAC8對(duì)肝癌細(xì)胞活力的影響在96孔板中接種細(xì)胞懸液,將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)。向每孔加入10μL CCK溶液,在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。2. PLAC8對(duì)肝腫瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞,分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞,并把細(xì)胞懸浮在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,然后將細(xì)胞懸液做梯度倍數(shù)稀釋。每組細(xì)胞分別以每皿50、100、200個(gè)細(xì)胞的梯度濃度分別接種含10 mL、37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中,并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng),使細(xì)胞分散均勻。置于37℃、5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí),終止培養(yǎng)。棄去上清液,用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細(xì)胞5 mL,固定15min。然后去固定液,加入適量的GIMSA應(yīng)用染色液染色10-30 min,然后用流水緩慢洗去染色液,空氣干燥。將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片,用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆,或在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆倍數(shù)。3. PLAC8對(duì)細(xì)胞周期的影響Western blot檢測(cè)PLAC8對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白R(shí)b和CCND1蛋白水平的影響。四、PLAC8抑制肝腫瘤發(fā)生的機(jī)制1.PLAC8對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響Real-time PCR檢測(cè)PLAC8與Wnt信號(hào)通路靶基因c-Myc間的相關(guān)性；Western blot檢測(cè)Hep3B細(xì)胞中PLAC8與c-Myc在蛋白水平上的相互作用；熒光素酶報(bào)告分析檢測(cè)Hep3B、HepG2細(xì)胞中PLAC8對(duì)β-catenin的影響。2. PLAC8對(duì)Akt/GSK3β/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控作用Western blot檢測(cè)Hep3B、HepG2細(xì)胞中PLAC8對(duì)p-Ak、Akt、p-GSK3β、 GSK3β、β-catenin蛋白水平的影響。五、肝癌發(fā)生過程中PLAC8水平下調(diào)的機(jī)制1. Real-time PCR檢測(cè)正常肝組織和肝癌組織中miR-185-5p的mRNA水平。2.應(yīng)用Real-time PCR對(duì)PLAC8與miR-185-5p的mRNA水平進(jìn)行相關(guān)性分析。3.熒光素酶報(bào)告分析檢測(cè)Hep3B細(xì)胞中miR-185-5p對(duì)PLAC8的調(diào)控作用。4. Western blot檢測(cè)Hep3B、HepG2細(xì)胞中miR-185-5p對(duì)PLAC8的調(diào)控作用。5.Huh7細(xì)胞中檢測(cè)miR-185-5p和PLAC8的相互作用對(duì)細(xì)胞活力的影響。六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用X±s表示,Shapiro-Wilk對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn),非正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)變換。兩組間計(jì)量資料差異比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)量資料多組間差異用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析,根據(jù)Levene方差齊性檢驗(yàn),組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。[結(jié)果]一、PLAC8在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中表達(dá)水平降低1.肝癌中PLAC8 mRNA表達(dá)水平顯著降低Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,同正常肝組織相比,PLAC8的mRNA水平在肝腫瘤組織中顯著降低(p0.0001)。2.肝腫瘤組織中PLAC8 mRNA表達(dá)水平顯著降低通過對(duì)肝癌患者肝腫瘤組織和肝腫瘤周圍組織的PLAC8 mRNA水平進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè),結(jié)果顯示PLAC8的mRNA表達(dá)在肝腫瘤組織中顯著降低(p0.0001)。3.肝癌病人肝腫瘤組織中PLAC8的蛋白表達(dá)水平降低免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果顯示,136名肝癌患者中,有84名患者的PLAC8表達(dá)水平在肝腫瘤組織中降低,分別有26名患者的PLAC8表達(dá)水平在肝腫瘤組織中保持不變或升高。4.低表達(dá)水平的PLAC8伴隨著肝癌患者存活率的降低生存分析結(jié)果顯示,低表達(dá)水平PLAC8的84名患者存活率相對(duì)較低,而高表達(dá)水平PLAC8的患者生存率較高(p=0.011)。二、PLAC81印制腫瘤的生長(zhǎng)通過構(gòu)建肝癌小鼠模型,結(jié)果顯示過表達(dá)PLAC8的小鼠肝腫瘤體積顯著降低(p0.01)。三、PLAC8抑制肝腫瘤細(xì)胞活力及增殖能力1.PLAC8抑制肝癌細(xì)胞的活力熒光素酶報(bào)告分析結(jié)果顯示,在Huh7、SMMC-7721、HepG2、Hep3B四種肝癌細(xì)胞系中,過表達(dá)的PLAC8抑制了細(xì)胞的活力(p 0.01); PLAC8的抑制使細(xì)胞活力得到了恢復(fù)(p0.01)。2. PLAC8抑制肝癌細(xì)胞的增殖克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在Huh7、SMMC-7721肝癌細(xì)胞系中,過表達(dá)的PLAC8抑制了細(xì)胞克隆數(shù)量(p0.001)。3.PLAC8抑制細(xì)胞周期進(jìn)程Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,過表達(dá)的PLAC8抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白R(shí)b蛋白的磷酸化,以及CCND1蛋白的表達(dá)。四、PLAC8通過調(diào)控Wnt/β-catenin及Akt/GSK3β/β-catenin信號(hào)通路抑制肝腫瘤的發(fā)生1.PLAC8抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路從而抑制肝腫瘤的發(fā)生Real-time PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,PLAC8與c-Myc呈負(fù)相關(guān)；熒光素酶報(bào)告分析結(jié)果表明,在Hep3B和HepG2細(xì)胞中,PLAC8能調(diào)控β-catenin使其水平降低。2. PLAC8抑制Akt/GSK3β/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而抑制肝腫瘤的發(fā)生Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,在Hep3B和HepG2細(xì)胞中,PLAC8抑制P-Akt及β-catenin蛋白水平,促進(jìn)GSK3β蛋白的磷酸化水平。五、在肝癌發(fā)生過程中,miR-185-5p抑制PLAC8的表達(dá)1.肝癌中miR-185-5p水平顯著升高。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示miR-185-5p在肝腫瘤組織中顯著升高(p0.0001)。2. miR-185-5p與PLAC8 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示miR-185-5p與PLAC8的]mRNA水平呈負(fù)相關(guān)。3.miR-185-5p抑制PLAC8水平熒光素酶報(bào)告分析結(jié)果表明miR-185-5p抑制PLAC8的表達(dá)；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示tniR-185-5p下調(diào)PLAC8的蛋白表達(dá)水平。4.miR-185-5p抑制PLAC8進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞活力miR-185-5p與PLAC8的相互作用增強(qiáng)了細(xì)胞的活力。[結(jié)論]1.PLAC8在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中,表達(dá)水平顯著降低。2. PLAC8能抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。3. PLAC8對(duì)肝癌細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖能力以及細(xì)胞周期的進(jìn)程起到抑制作用。4. PLAC8通過調(diào)控Wnt/β-catenin及Akt/GSK3/β-catenin信號(hào)通路抑制肝癌的發(fā)生。5.miR-185-5p能調(diào)控PLAC8的表達(dá)水平,下調(diào)其表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

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