本文選題：PLAC8　切入點：肝癌　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：[背景及目的]在世界范圍內(nèi),肝癌仍然是癌癥致死的主要原因之一,是第三大致死性癌癥,每年的死亡數(shù)高達100萬。近些年來,雖然肝癌的臨床研究取得了很大的進展,但肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的機制目前還尚不完全清楚。隨著對肝癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)肝癌細胞內(nèi)部的某些轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活或抑制與肝癌的發(fā)生、發(fā)展等有著緊密的聯(lián)系。通過對癌癥信號通路的抑制治療癌癥是近年來腫瘤臨床治療方面的重大突破。應(yīng)用siRNA沉默β-catenin基因及蛋白質(zhì)的表達,并使細胞周期阻滯于G0/G1期。一次轉(zhuǎn)染可在一定時間內(nèi)抑制肝癌細胞的生長,在肝癌的治療中起一定的作用,但不能治愈肝癌。肝癌細胞中β-catenin信號傳導(dǎo)通路可以調(diào)節(jié)肝癌的細胞生長、細胞周期、細胞凋亡、血管生成因子、端粒酶及其它信號通路等,因此抑制β-catenin信號通路在肝癌的治療中起一定的作用。胎盤特異蛋白8 (PLAC8),又稱為onzin8,富含半胱氨酸蛋白,在人類的樹突狀細胞中首次被發(fā)現(xiàn)。PLAC8基因大小近700 bp,其開放閱讀框的長度約348 bp,但一些RNA印跡表明在某些器官中其]mRNA長度為4400-7000 bp。PLAC8蛋白分子質(zhì)量為12.4 kDa,在一些哺乳動物中其信號肽的限制酶結(jié)合位點具有相似性,并且氨基酸序列中富含占據(jù)10%總長的半胱氨酸,比如,在全長的人PLAC8中,每112個氨基酸就包含15個半胱氨酸；在全長的鼠PLAC8中每115個氨基酸包含16個半胱氨酸。大部分的半胱氨酸形成CXXC結(jié)構(gòu),形成分子內(nèi)部的二硫鍵,該結(jié)構(gòu)是結(jié)合其底物的特殊位點�；蚪M分析表明人PLAC8基因位于染色體4q13-4q21,包含由U2 GT-AG連接的5個外顯子。它參與調(diào)控癌癥,細胞凋亡以及細胞的分化過程。相關(guān)報道指出PLAC8是肝癌發(fā)生的標記物,但是它在癌癥早期高表達,之后其表達水平又逐漸降低。但PLAC8在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的研究較少,其對肝癌發(fā)生到底起抑制作用還是促進作用仍不明確；在癌癥中,其具體的作用機制也未見報道,同時,調(diào)控PLAC8表達的相關(guān)因子也尚未加以研究。本課題旨在檢測PLAC8在肝癌發(fā)生過程中的表達,并探討其作用機制,為HCC分子機制的探究尋找新的依據(jù)。[方法]一, PLAC8在肝癌中的表達1.肝癌病人肝臟同正常肝臟的PLAC8表達水平檢測分別提取肝癌病人肝臟和正常肝臟中的RNA,通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,應(yīng)用Real-time PCR檢測PLAC8的mRNA表達情況。2.肝癌病人肝腫瘤周圍組織和腫瘤組織中PLAC8的mRNA表達水平檢測分別提取肝癌患者肝腫瘤周圍組織和腫瘤組織中的RNA,通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,應(yīng)用Real-time PCR檢測PLAC8的mRNA表達情況。3.肝癌病人肝腫瘤周圍組織和腫瘤組織中PLAC8的蛋白水平檢測對136例肝癌病人的肝腫瘤周圍組織和腫瘤組織進行免疫組織化學(xué)染色,檢測PLAC8蛋白水平的變化情況。4. PLAC8水平對肝癌患者生存率的影響對136例肝癌患者的生存時間進行統(tǒng)計,并對PLAC8水平的高低和生存時間作圖。二、PLAC8對腫瘤生長的影響Huh7細胞過表達PLAC8原位接種構(gòu)建腫瘤模型將過表達PLAC8的Huh7細胞或空載體細胞以1×106/只注射至雌性BALB/c (nu/nu)小鼠肝臟中,4周后處死小鼠,取出肝臟拍照并對腫瘤體積進行統(tǒng)計。三、PLAC8對肝腫瘤細胞生物學(xué)特性的影響1.PLAC8對肝癌細胞活力的影響在96孔板中接種細胞懸液,將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)。向每孔加入10μL CCK溶液,在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4 h后用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。2. PLAC8對肝腫瘤細胞克隆形成能力的影響取對數(shù)生長期的各組細胞,分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞,并把細胞懸浮在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,然后將細胞懸液做梯度倍數(shù)稀釋。每組細胞分別以每皿50、100、200個細胞的梯度濃度分別接種含10 mL、37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中,并輕輕轉(zhuǎn)動,使細胞分散均勻。置于37℃、5%CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周。當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時,終止培養(yǎng)。棄去上清液,用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細胞5 mL,固定15min。然后去固定液,加入適量的GIMSA應(yīng)用染色液染色10-30 min,然后用流水緩慢洗去染色液,空氣干燥。將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片,用肉眼直接計數(shù)克隆,或在顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)大于10個細胞的克隆倍數(shù)。3. PLAC8對細胞周期的影響Western blot檢測PLAC8對細胞周期相關(guān)蛋白Rb和CCND1蛋白水平的影響。四、PLAC8抑制肝腫瘤發(fā)生的機制1.PLAC8對Wnt/β-catenin信號通路的影響Real-time PCR檢測PLAC8與Wnt信號通路靶基因c-Myc間的相關(guān)性；Western blot檢測Hep3B細胞中PLAC8與c-Myc在蛋白水平上的相互作用；熒光素酶報告分析檢測Hep3B、HepG2細胞中PLAC8對β-catenin的影響。2. PLAC8對Akt/GSK3β/β-catenin信號通路的調(diào)控作用Western blot檢測Hep3B、HepG2細胞中PLAC8對p-Ak、Akt、p-GSK3β、 GSK3β、β-catenin蛋白水平的影響。五、肝癌發(fā)生過程中PLAC8水平下調(diào)的機制1. Real-time PCR檢測正常肝組織和肝癌組織中miR-185-5p的mRNA水平。2.應(yīng)用Real-time PCR對PLAC8與miR-185-5p的mRNA水平進行相關(guān)性分析。3.熒光素酶報告分析檢測Hep3B細胞中miR-185-5p對PLAC8的調(diào)控作用。4. Western blot檢測Hep3B、HepG2細胞中miR-185-5p對PLAC8的調(diào)控作用。5.Huh7細胞中檢測miR-185-5p和PLAC8的相互作用對細胞活力的影響。六、統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析,實驗數(shù)據(jù)采用X±s表示,Shapiro-Wilk對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗,非正態(tài)分布數(shù)據(jù)進行對數(shù)變換。兩組間計量資料差異比較采用t檢驗。計量資料多組間差異用完全隨機設(shè)計方差分析,根據(jù)Levene方差齊性檢驗,組間兩兩比較采用LSD檢驗分析。檢驗水準α=0.05。[結(jié)果]一、PLAC8在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中表達水平降低1.肝癌中PLAC8 mRNA表達水平顯著降低Real-time PCR檢測結(jié)果顯示,同正常肝組織相比,PLAC8的mRNA水平在肝腫瘤組織中顯著降低(p0.0001)。2.肝腫瘤組織中PLAC8 mRNA表達水平顯著降低通過對肝癌患者肝腫瘤組織和肝腫瘤周圍組織的PLAC8 mRNA水平進行Real-time PCR檢測,結(jié)果顯示PLAC8的mRNA表達在肝腫瘤組織中顯著降低(p0.0001)。3.肝癌病人肝腫瘤組織中PLAC8的蛋白表達水平降低免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果顯示,136名肝癌患者中,有84名患者的PLAC8表達水平在肝腫瘤組織中降低,分別有26名患者的PLAC8表達水平在肝腫瘤組織中保持不變或升高。4.低表達水平的PLAC8伴隨著肝癌患者存活率的降低生存分析結(jié)果顯示,低表達水平PLAC8的84名患者存活率相對較低,而高表達水平PLAC8的患者生存率較高(p=0.011)。二、PLAC81印制腫瘤的生長通過構(gòu)建肝癌小鼠模型,結(jié)果顯示過表達PLAC8的小鼠肝腫瘤體積顯著降低(p0.01)。三、PLAC8抑制肝腫瘤細胞活力及增殖能力1.PLAC8抑制肝癌細胞的活力熒光素酶報告分析結(jié)果顯示,在Huh7、SMMC-7721、HepG2、Hep3B四種肝癌細胞系中,過表達的PLAC8抑制了細胞的活力(p 0.01); PLAC8的抑制使細胞活力得到了恢復(fù)(p0.01)。2. PLAC8抑制肝癌細胞的增殖克隆形成實驗結(jié)果顯示,在Huh7、SMMC-7721肝癌細胞系中,過表達的PLAC8抑制了細胞克隆數(shù)量(p0.001)。3.PLAC8抑制細胞周期進程Western blot檢測結(jié)果顯示,過表達的PLAC8抑制細胞周期相關(guān)蛋白Rb蛋白的磷酸化,以及CCND1蛋白的表達。四、PLAC8通過調(diào)控Wnt/β-catenin及Akt/GSK3β/β-catenin信號通路抑制肝腫瘤的發(fā)生1.PLAC8抑制Wnt/β-catenin信號通路從而抑制肝腫瘤的發(fā)生Real-time PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示,PLAC8與c-Myc呈負相關(guān)；熒光素酶報告分析結(jié)果表明,在Hep3B和HepG2細胞中,PLAC8能調(diào)控β-catenin使其水平降低。2. PLAC8抑制Akt/GSK3β/β-catenin信號通路進而抑制肝腫瘤的發(fā)生Western blot檢測結(jié)果顯示,在Hep3B和HepG2細胞中,PLAC8抑制P-Akt及β-catenin蛋白水平,促進GSK3β蛋白的磷酸化水平。五、在肝癌發(fā)生過程中,miR-185-5p抑制PLAC8的表達1.肝癌中miR-185-5p水平顯著升高。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示miR-185-5p在肝腫瘤組織中顯著升高(p0.0001)。2. miR-185-5p與PLAC8 mRNA水平呈負相關(guān)Real-time PCR檢測結(jié)果顯示miR-185-5p與PLAC8的]mRNA水平呈負相關(guān)。3.miR-185-5p抑制PLAC8水平熒光素酶報告分析結(jié)果表明miR-185-5p抑制PLAC8的表達；Western blot檢測結(jié)果顯示tniR-185-5p下調(diào)PLAC8的蛋白表達水平。4.miR-185-5p抑制PLAC8進而增強細胞活力miR-185-5p與PLAC8的相互作用增強了細胞的活力。[結(jié)論]1.PLAC8在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中,表達水平顯著降低。2. PLAC8能抑制肝癌細胞的生長。3. PLAC8對肝癌細胞活力、細胞增殖能力以及細胞周期的進程起到抑制作用。4. PLAC8通過調(diào)控Wnt/β-catenin及Akt/GSK3/β-catenin信號通路抑制肝癌的發(fā)生。5.miR-185-5p能調(diào)控PLAC8的表達水平,下調(diào)其表達。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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