本文選題：結直腸癌　切入點：miR-206　出處：《南京醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景和目的：眾所周知,基因突變、表型漂移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、集體遷移、抑制細胞凋亡及失巢凋亡、血管和淋巴管轉(zhuǎn)移是當前腫瘤的轉(zhuǎn)移機制。研究表明,microRNAs主要是通過調(diào)節(jié)基因表達進而影響腫瘤發(fā)展,從而在致癌機制中發(fā)揮著重要作用,如抑制癌細胞的增殖和遷移、阻斷細胞周期、激活細胞凋亡。當某一特定的miRNA證實參與腫瘤轉(zhuǎn)移過程,那么沉默該項癌基因或上調(diào)腫瘤的抑癌基因可作為腫瘤的潛在治療策略.microRNA.206(miR-206),是MyomiRs家族成員之一,在人類許多惡性腫瘤(包括結直腸癌)中的表達下調(diào),并且與更多的惡性表型相關聯(lián),在惡性腫瘤的發(fā)生和進展中起著重要的作用。結直腸癌(Colorectal cancer CRC)是全球范圍內(nèi)最常見的腫瘤之一,腫瘤轉(zhuǎn)移及病情進展是導致CRC患者死亡的主要原因。因此,在結直腸癌中進一步研究miR-206的調(diào)控機制具有重要意義。近來研究顯示,在HeLa細胞和C2C12細胞中miR-206經(jīng)由靶向調(diào)控NOTCH3通路發(fā)揮抑制作用。目前,在CRC中miR-206是否能夠靶向調(diào)控NOTCH3的研究未有報道。因此,在CRC中,我們試圖探討miR-206及其目標NOTCH3對腫瘤抑制和轉(zhuǎn)移的影響。資料和方法：采用49例接受手術治療的結直腸癌的患者(Ⅰ期及Ⅱ期歸為非轉(zhuǎn)移性疾病n =28:III期和Ⅳ期轉(zhuǎn)移性疾病n=21)的腫瘤組織和正常組織的切片標本,用免疫組化方法檢測NOTCH3及原位雜交法檢測miR-206在組織中的分布。在腫瘤組織和正常組織中,使用RT-PCR方法定量miR-206的表達水平(RNU6-1作為內(nèi)參),Westemblot檢測NOTCH3蛋白表達(ACTB作為內(nèi)參)。培養(yǎng)結腸癌細胞(SW480)和轉(zhuǎn)移瘤株(SW620)進行后續(xù)一系列實驗。通過miR-206mimic轉(zhuǎn)染SW480. SW620細胞后,檢測NOTCH3 mRNA及蛋白表達。在細胞轉(zhuǎn)染后,分別用MTT法檢測細胞活力,流式細胞儀檢測細胞凋亡以及Western blotting法檢測caspase-3的蛋白表達。流式細胞儀測定細胞周期分布和GO/G1、S、G2/M期細胞的比例。要確定是否miR-206影響CRC細胞遷移,采用兩種方法(劃痕試驗和Boyden小室檢測)進行細胞遷移實驗。此外,miR-206轉(zhuǎn)染SW480、SW620細胞后,檢測NOTCH3轉(zhuǎn)錄靶基因(JAG1和HEY1)和轉(zhuǎn)移相關基因(CDH2和MMP9) mRNA的表達水平。結果：結直腸癌中,Ⅰ-Ⅱ期患者或III-IV期的腫瘤組織和正常組織之間的miR-206表達有顯著差異,腫瘤組織中miR-206表達水平明顯下調(diào)。與此相反,NOTCH3蛋白在腫瘤組織中明顯上調(diào),而在正常組織中僅有最小檢測。原位雜交技術顯示,miR-206在正常粘膜中呈弱表達,但在腫瘤組織卻沒有表達。免疫組化實驗中,NOTCH3主要定位在細胞質(zhì)和細胞核的腫瘤細胞,并且具有很強的染色,而在正常黏膜很少可見。在用miR-206mimic轉(zhuǎn)染結腸癌細胞SW480和轉(zhuǎn)移細胞株SW620后,相比對照組,NOTCH3mRNA和蛋白水平均中均顯著降低。MTT檢測miR-206 mimic轉(zhuǎn)染后細胞活力顯著降低。細胞周期表明,G0/G1期細胞比例明顯升高而在S期和G2/M期細胞比例明顯減少。miR-206 mimic轉(zhuǎn)染的細胞導致凋亡數(shù)量增加以及caspase-3的含量上調(diào)。miR-206 mimic轉(zhuǎn)染細胞中,傷口閉合能力及細胞遷移的能力顯著降低。在SW480、SW620細胞中miR-206 mimic轉(zhuǎn)染后,兩個NOTCH轉(zhuǎn)錄靶基因(JAG1和HEY1)和轉(zhuǎn)移相關基因(CDH2和MMP9) mRNA的表達水平均明顯下調(diào)。結論：miR-206表達上調(diào)抑制CRC腫瘤細胞的增殖和遷移、阻斷細胞周期并且激活細胞凋亡。miR-206的腫瘤抑制能力在不同的CRC細胞中有著相似的效果,但具有著不同的轉(zhuǎn)移潛能,并可通過直接抑制NOTCH3信號以及涉及CDH2和MMP9其他信號轉(zhuǎn)導通路間接作用來發(fā)揮作用。研究結果表明,miR-206作為CRC中一種腫瘤抑制基因,可作為臨床治療的一個潛在靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34

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本文編號：1562212