本文選題：HOXD3　切入點(diǎn)：結(jié)腸癌　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,發(fā)病率位居消化道腫瘤第三位。在我國(guó),由于人們生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的變化,以及結(jié)腸癌起病隱匿,發(fā)展緩慢,早期難以察覺(jué),發(fā)現(xiàn)時(shí)多已處于中晚期,各種治療手段效果均不理想,結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌患者死亡的主要原因,結(jié)腸炎癥、異常增殖、分化、凋亡等多種機(jī)制與結(jié)腸癌的發(fā)病過(guò)程密切相關(guān)。HOX基因是同源盒基因(homeobox gene)大家族中的一員,是生物進(jìn)化過(guò)程中具有高度保守性的一類基因。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)HOX基因在細(xì)胞增殖與分化、決定細(xì)胞表型以及在胚胎發(fā)育等方面起關(guān)鍵作用,其表達(dá)失調(diào)會(huì)引起胚胎發(fā)育過(guò)程中機(jī)體畸形,以及腫瘤的發(fā)生。HOXD3基因是HOX家族基因的第三旁系同源基因群成員,HOXD3基因表達(dá)異�？蓪�(dǎo)致組織器官發(fā)育異常,以及血管異常生長(zhǎng)。相關(guān)研究顯示HOXD3的異常表達(dá)可能會(huì)通過(guò)改變細(xì)胞粘附因子和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá),促使肺癌、乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。本研究通過(guò)觀察結(jié)腸癌組織中HOXD3的表達(dá)情況,以及在結(jié)腸癌RKO細(xì)胞中HOXD3所發(fā)揮的生物學(xué)調(diào)控功能,分析HOXD3基因?qū)Y(jié)腸癌增殖、凋亡作用的分子調(diào)控機(jī)制,為結(jié)腸癌的臨床診療和預(yù)后評(píng)估提供新的參考途徑。目的研究HOXD3基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)以及對(duì)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,分析HOXD3的基因?qū)Y(jié)腸癌增殖、凋亡作用的分子調(diào)控機(jī)制。方法1、免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸癌病理組織與正常組織中HOXD3的表達(dá)情況;采用Spearman相關(guān)分析法對(duì)84例結(jié)腸癌患者的性別、年齡、分化程度、浸潤(rùn)深度、TNM分期等臨床病理特征與HOXD3表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析。2、采用RT-PCR法檢測(cè)DLD-1、HCT116、SW620、HT-29、RKO結(jié)腸癌細(xì)胞株中HOXD3基因的表達(dá);制備、包裝HOXD3基因RNAi慢病毒載體并感染RKO細(xì)胞;通過(guò)Cellomics細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)HOXD3基因敲減后RKO細(xì)胞生長(zhǎng)情況;用MTT法檢測(cè)HOXD3基因敲減后RKO細(xì)胞增殖情況;檢測(cè)HOXD3基因敲減后RKO細(xì)胞克隆形成能力的變化情況;用熒光活化細(xì)胞分選方法檢測(cè)HOXD3基因敲減后對(duì)RKO細(xì)胞細(xì)胞周期以及凋亡情況的影響。3、Affymetrix基因表達(dá)譜芯片分析HOXD3敲減后影響RKO細(xì)胞增殖、凋亡作用的信號(hào)通路及下游差異基因;用q PCR法驗(yàn)證RKO細(xì)胞中下游差異基因的表達(dá)情況。結(jié)果1、HOXD3在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織,在高-中分化、低分化結(jié)腸癌組織中陽(yáng)性率分別為68.2%(30/44)、70%(28/40),顯著高于癌旁正常組織9.1%(3/33)。結(jié)腸癌患者HOXD3基因的表達(dá)與TNM分期、浸潤(rùn)程度相關(guān),腫瘤臨床分期越晚、浸潤(rùn)程度越深,HOXD3表達(dá)陽(yáng)性率越高;HOXD3的表達(dá)與患者性別、年齡、分化程度無(wú)相關(guān)性。2、在DLD-1、HCT116、SW620、HT-29四種結(jié)腸癌細(xì)胞株中HOXD3基因中度表達(dá),而在RKO細(xì)胞株中HOXD3基因呈現(xiàn)高表達(dá)。將目的基因RNA干擾慢病毒載體感染RKO細(xì)胞,經(jīng)q PCR檢測(cè)感染后的RKO細(xì)胞中HOXD3基因敲減效率達(dá)到53.9%,在m RNA水平的表達(dá)量受到顯著抑制;在腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞中HOXD3基因的外源表達(dá)蛋白水平也顯著降低。經(jīng)sh RNA慢病毒感染后,與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組RKO細(xì)胞的增殖速率受到顯著抑制,而且RKO細(xì)胞集落數(shù)目減少。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組處于G1期、S期的細(xì)胞數(shù)顯著減少,而處于G2期的細(xì)胞數(shù)顯著增多。通過(guò)Annexin V-APC單染法檢測(cè),顯示實(shí)驗(yàn)組發(fā)生凋亡的RKO細(xì)胞數(shù)顯著增加。提示HOXD3基因敲減后,RKO細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞周期G2期阻滯,并誘發(fā)了細(xì)胞凋亡。3、基因芯片分析結(jié)果顯示,HOXD3敲減后RKO細(xì)胞中有366個(gè)差異基因表達(dá)上調(diào),377個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。通過(guò)IPA通路分析軟件發(fā)現(xiàn),與HOXD3作用相關(guān)的信號(hào)途徑中,ERK-MAPK信號(hào)通路顯著被抑制,在通路中富集的相關(guān)差異基因有PIK3R3、PAK6、ARAF、PPM1J、PIK3C3、RAC1、STAT1、RAP1A、PLA2G12A等9個(gè)相互作用密切的基因;P53信號(hào)通路被激活,存在PIK3R3、BCL2L1、PMAIP1、TP53INP1、CCND2、PIK3C3、CDKN1A、CCNK、RRM2B、TIGAR、MDM2、FAS等12個(gè)與其相關(guān)的差異基因。采用q QCR法對(duì)兩條通路中的ARAF、RAC1、RAP1A、PLA2G12A、PIK3R3、PIK3C3六個(gè)基因的表達(dá)情況進(jìn)行了驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)ARAF表達(dá)顯著上調(diào),RAC1、RAP1A、PLA2G12A、PIK3R3、PIK3C3表達(dá)均顯著下調(diào)。結(jié)論1、HOXD3基因在結(jié)腸癌癌旁組織中低表達(dá),在癌組織中高表達(dá);HOXD3基因高表達(dá)與腫瘤TNM臨床分期、腫瘤浸潤(rùn)深度呈正相關(guān),與患者年齡、性別、腫瘤分化程度不相關(guān)。2、在RKO結(jié)腸癌細(xì)胞株中HOXD3基因高表達(dá);HOXD3基因敲減后,RKO細(xì)胞增殖、克隆形成能力顯著被抑制,細(xì)胞周期阻滯在G2期,細(xì)胞凋亡程度顯著增加。3、基因HOXD3被敲減后,細(xì)胞內(nèi)ERK-MAPK信號(hào)通路顯著被抑制,P53信號(hào)通路被激活。通路中HOXD3下游差異基因ARAF表達(dá)上調(diào),RAC1、RAP1A、PLA2G12A、PIK3R3、PIK3C3表達(dá)下調(diào),這些基因通過(guò)ERK-MAPK和p53通路的交互作用,發(fā)揮了抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.35

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8 宋e，

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