本文選題：膽汁酸受體　切入點(diǎn)：動(dòng)物模型　出處：《山東大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景與目的：Barrett食管(Barrett's esophagus, BE)是一種癌前病變,是指正常食管鱗狀上皮被包含杯狀細(xì)胞的柱狀上皮所取代的一種病理現(xiàn)象。BE發(fā)生與食管慢性炎癥刺激相關(guān),BE引起的細(xì)胞轉(zhuǎn)化,是食管腺癌的重要重要致病因素。目前已經(jīng)證實(shí)導(dǎo)致BE發(fā)生的一個(gè)重要因素是慢性胃食管反流癥(GERD).5-10%的胃食管反流患者在內(nèi)鏡下發(fā)現(xiàn)Barrett食管。研究表明,十二指腸-胃-食管反流在BE的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。食管鱗狀上皮細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間受返流液刺激可能使食管粘膜內(nèi)膽汁酸易感受體異位表達(dá),促進(jìn)產(chǎn)生BE并進(jìn)一步發(fā)展為食管腺癌,又稱之為Barrett's腺癌(BA)。BE患者發(fā)生食管腺癌的風(fēng)險(xiǎn)要比正常人高。而且,在過(guò)去的幾十年中,BA的發(fā)生率有明顯的增長(zhǎng)。但是BE發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,以往通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)方式研究化生及腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制,但是由于機(jī)體內(nèi)免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性,尚不能很好地反映生物體內(nèi)食管粘膜由鱗狀上皮到BE甚至食管腺癌的過(guò)程。以往研究表明引起食管損傷及炎癥最重要的因素是胃反流物中的胃酸及胃蛋白酶。長(zhǎng)期暴露于胃酸及消化酶的環(huán)境中,食管粘膜受到損傷,并發(fā)生柱狀上皮化生,進(jìn)而替代正常的食管鱗狀上皮。最近研究發(fā)現(xiàn)反流液中膽汁酸鹽在食管粘膜損傷及化生中起到重要作用。一些臨床研究檢測(cè)表明BE患者中膽汁酸鹽反流更為常見(jiàn),BE患者食管內(nèi)膽汁酸鹽濃度明顯高于單純的胃食管反流患者。另外有體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證明膽汁酸鹽在BE的發(fā)生過(guò)程中具有促進(jìn)作用。膽汁酸通過(guò)與其受體結(jié)合而發(fā)揮作用,膽汁酸受體(FXR)的變化與腫的發(fā)生發(fā)展有關(guān),研究發(fā)現(xiàn)FXR在BE組織中高表達(dá),提示膽汁酸及其受體在BE發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。BE化生過(guò)程通常伴隨腸道特異性基因的表達(dá),在食管粘膜腸上皮化生過(guò)程中的一個(gè)初始誘導(dǎo)基因是CDX-2。CDX-2是腸道特異性表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子,其基因表達(dá)增強(qiáng)往往與胃腸道粘膜上皮化生和異形性增生以及腫瘤的發(fā)生相關(guān)。另外體外細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),CDX-2具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化的作用,而且研究證實(shí)CDX-2與Muc2啟動(dòng)子相互作用并激發(fā)其轉(zhuǎn)錄,從而在杯狀細(xì)胞分化中起到重要作用。在胃食管反流液慢性刺激下食管扁平鱗狀上皮區(qū)域出現(xiàn)CDX-2及Muc2表達(dá),可以證實(shí)食管粘膜已經(jīng)在致病因素的作用下啟動(dòng)化生過(guò)程。膽汁酸鹽的致癌作用與其引起食管粘膜的慢性炎癥反應(yīng)有關(guān),臨床研究發(fā)現(xiàn)BE上皮細(xì)胞中促炎基因如COX-2、PPAR-g、促炎細(xì)胞因子等表達(dá)上調(diào),粘膜炎癥程度加重以及BE發(fā)生率與組織中PGE2水平的升高顯著相關(guān),COX-2是PGs合成中的關(guān)鍵性限速酶,COX-2高表達(dá)后能夠引起食管粘膜組織中前列腺素E2(PGE2)水平升高,粘膜的炎癥程度相應(yīng)加重。另外研究認(rèn)為慢性炎癥可能通過(guò)促進(jìn)釋放氧自由基(ROS)引起的氧化應(yīng)激而引起B(yǎng)E的發(fā)生發(fā)展,各種炎性介質(zhì)誘導(dǎo)ROS釋放,因此導(dǎo)致食管粘膜持續(xù)慢性氧化應(yīng)激損傷,并隨著食管炎癥加重,Barrett食管及腺癌的發(fā)生率相應(yīng)升高。另外,在BE化生及腫瘤發(fā)生過(guò)程中伴隨著一系列信號(hào)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等表達(dá),如Bmp4、Tff2、Krt19等。Bmp4作為BE上皮的標(biāo)志性蛋白,膽汁酸可以通過(guò)Bmp4信號(hào)通路調(diào)節(jié)CDX-2的表達(dá)并促進(jìn)食管鱗狀上皮腸化生。Tff2對(duì)食管粘膜具有保護(hù)作用,促進(jìn)損傷粘膜的修復(fù),在炎性病變中上調(diào)表達(dá),Krt19是上皮細(xì)胞的骨架蛋白,在上皮原發(fā)腫瘤中表達(dá),并可以作為上皮源性腫瘤的微轉(zhuǎn)移標(biāo)記物。通過(guò)對(duì)Bmp4、Tff2、Krt19等基因表達(dá)的檢測(cè),有助于我們了解BE及EAC的病理生理的機(jī)制。本研究著重通過(guò)人體BE組織標(biāo)本及動(dòng)物模型食管病變標(biāo)本,對(duì)膽汁酸在BE發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。為進(jìn)一步研究膽汁酸及其受體與BE的發(fā)生發(fā)展提供依據(jù)。材料和方法：1.材料1.1人體BE組織標(biāo)本來(lái)源于山東省千佛山醫(yī)院2010～2014門(mén)診及住院患者經(jīng)內(nèi)鏡醫(yī)師及病理科醫(yī)師進(jìn)行病理確診的BE病人20例,取得患者同意,采取患者BE病變標(biāo)本組織及周圍正常食管粘膜作對(duì)照。BE標(biāo)本采取自胃食管交界處開(kāi)始向上每個(gè)厘米均采取相應(yīng)四個(gè)象限標(biāo)本。1.2 Wister大鼠的分組與處理2月大Wister雄性大鼠(重約250g-280g)購(gòu)于山東大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心,分為手術(shù)組和非手術(shù)組。在手術(shù)組分設(shè)三組,A組包含30只大鼠,通過(guò)手術(shù)行全胃切除,十二指腸近端封閉,并行食管-十二指腸端側(cè)吻合術(shù),形成單純膽汁酸反流組。B組包含30只大鼠,行食管胃交界處縱行切開(kāi)并與十二指腸行側(cè)側(cè)吻合術(shù),手術(shù)造成胃酸及膽汁酸混合性反流。C組為對(duì)照組,10只大鼠行單純開(kāi)腹關(guān)腹手術(shù)。非手術(shù)組大鼠也分設(shè)三組,D組包含30只大鼠,用含膽汁酸(0.3% DCA, pH 7.0)的飲用水進(jìn)行飼喂。E組30只大鼠用含胃蛋白酶(0.5mg/L)的酸性飲用水(HCl0. Olmol/L, pH2.0)進(jìn)行飼喂。F組為對(duì)照組,10只大鼠用正常飼料及清潔水飼喂。所有大鼠均飼養(yǎng)6個(gè)月,6個(gè)月后存活的大鼠處死后進(jìn)行進(jìn)一步研究。2.方法2.1人體BE標(biāo)本處理。2.1.1免疫組化法檢測(cè)FXR表達(dá)。Western blot檢測(cè)FXR蛋白表達(dá)。2.1.2應(yīng)用免疫組化染色檢測(cè)CDX-2及Muc2表達(dá)。2.1.3應(yīng)用Real-Time PCR法檢測(cè)人體BE組織及正常食管粘膜組織COX-2 mRNA水平。2.1.4對(duì)FXR與CDX-2、COX-2表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析。2.2模型動(dòng)物食管標(biāo)本處理。2.2.1組織學(xué)檢測(cè)大鼠麻醉后處死,取出食管組織,沿食管長(zhǎng)軸縱行剪開(kāi)食管,觀察食管大體病變情況,并將食管組織縱行均分成三份,分別進(jìn)行病理學(xué)及生化研究。食管HE染色切片經(jīng)兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師分別進(jìn)行病理診斷,食管病變分為角化過(guò)度、上皮增生、食管炎癥、食管潰瘍、Barrett's食管、及食管腺癌。2.2.2免疫組化法檢測(cè)食管FXR表達(dá),免疫組化染色檢測(cè)食管組織CDX-2及Muc2表達(dá)。2.2.3 ELISA法檢測(cè)動(dòng)物血漿中IL-6及TNF-a水平。2.2.4 Semi-quantitative RT-PCR法檢測(cè)Cdx2、Muc2、Bmp4, Kit19以及Tff2基因的表達(dá)。結(jié)果：1.人體BE組織實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.1 FXR在人體BE組織中表達(dá)明顯升高。本實(shí)驗(yàn)中共包含20例BE患者,免疫組化法染色顯示BE組織中FXR染色陽(yáng)性,其中以核染色為主,周邊組織亦有染色,正常食管粘膜組織FXR陽(yáng)性染色少見(jiàn)。West blot檢測(cè)顯示FXR在BE組織中高表達(dá),在正常食管粘膜組織中無(wú)表達(dá)或弱表達(dá),具有顯著性差異。1.2免疫組化染色顯示,人體BE組織中CDX-2、Muc2表達(dá)弱陽(yáng)性至強(qiáng)陽(yáng)性,在正常食管粘膜中幾乎不表達(dá),分析發(fā)現(xiàn)CDX-2、Muc2在正常食管粘膜組織中的表達(dá)顯著低于BE組織中的表達(dá)。較正常食管粘膜BE組織中CDX-2 mRNA水平明顯升高,具有顯著性差異。1.3 Real-Time PCR檢查顯示BE組織中COX-2 mRNA水平較正常食管粘膜組織明顯升高。1.4對(duì)FXR表達(dá)水平及CDX-2、COX-2表達(dá)水平分別進(jìn)行相關(guān)性分析,顯示FXR表達(dá)與CDX-2成表達(dá)成正相關(guān),與COX-2表達(dá)成正相關(guān),CDX-2表達(dá)與COX-2表達(dá)成正相關(guān)。2.動(dòng)物模型試驗(yàn)結(jié)果2.1 手術(shù)模型組中,與對(duì)照組相比兩種反流手術(shù)均導(dǎo)致食管炎癥、BE及食管腺癌的發(fā)生,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但兩組反流性手術(shù)之間發(fā)生食管炎癥、BE及食管腺癌的幾率并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與單純膽汁反流相比混合反流并未增加BE發(fā)生率(x2=0.0565,p0.05)。但是在非手術(shù)模型組中,與對(duì)照組相比喂食膽汁酸組與喂食胃酸及胃蛋白酶組均可導(dǎo)致食管炎癥及BE發(fā)生,而且兩組之間導(dǎo)致BE(x2=4.83,p0.05)發(fā)生的幾率具有明顯差異。2.2同人體組織一樣,FXR、CDX-2及Muc2在診斷為BE的大鼠食管組織中高表達(dá),在對(duì)照組中低表達(dá)或無(wú)表達(dá)。2.3在手術(shù)模型組中,單純膽汁酸反流導(dǎo)致食管炎癥發(fā)生率為80%,混合反流發(fā)生率為90.5%,兩者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.04,p0.05)。但是在非手術(shù)模型組中膽汁酸飼喂較加入胃蛋白酶的酸性液體飼喂導(dǎo)致食管炎癥的發(fā)生率有明顯不同(x2=8.96,p0.01)。在兩種返流手術(shù)組及膽汁酸飼喂組中檢測(cè)到IL-6和TNF-a的水平明顯升高,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.4通過(guò)Semi-quantitative RT-PCR法測(cè)得兩種反流手術(shù)組及膽汁酸飼喂組中CDX-2和Muc2表達(dá)水平升高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并與免疫組化結(jié)果一致。作為細(xì)胞分化增生的標(biāo)記Bmp4, Kit 19及Tff2表達(dá)水平在兩種反流手術(shù)組及膽汁酸飼喂組中也升高,結(jié)果具有顯著性差異(p0.05)。結(jié)論：FXR在BE中表達(dá)較正常食管粘膜組織明顯升高。BE組織中CDX-2、Muc2和COX-2表達(dá)明顯升高,并與FXR表達(dá)正相關(guān),通過(guò)成功建立起兩種動(dòng)物模型并研究證實(shí)膽汁酸而非胃酸是BE發(fā)生中的主要因素,膽汁酸及其受體導(dǎo)致BE的發(fā)生與其引發(fā)食管的炎性反應(yīng)有關(guān),引起炎性反應(yīng)介質(zhì)IL-6和TNF-a高表達(dá),并導(dǎo)致相應(yīng)的分化增生基因高表達(dá),最終導(dǎo)致BE的發(fā)生,抑制膽汁酸有可能成為預(yù)防治療BE的一種手段。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1560137