本文選題：過氧化物酶6　切入點(diǎn)：肝細(xì)胞肝癌　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景：肝細(xì)胞肝癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。中國是乙肝高發(fā)國家,每年肝癌新增病例占全球的一半以上。肝癌惡性程度高,起病隱匿,進(jìn)展快。肝癌切除術(shù)和肝移植是肝癌最有效的根治性手段,但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。僅部分早期肝癌的患者適合接受手術(shù)治療,不可切除肝癌或晚期肝癌預(yù)后差。因此,肝癌診斷和預(yù)后評判新型標(biāo)記物以及藥物治療靶點(diǎn)的研發(fā)至關(guān)重要。研究目的：本研究擬通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選肝細(xì)胞肝癌組織與配對癌旁組織間差異表達(dá)的蛋白,進(jìn)而在肝癌及癌旁組織中檢測其表達(dá)水平,并開展體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)闡明具體作用機(jī)制,為新型腫瘤標(biāo)記物和藥物作用位點(diǎn)的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。研究方法1.應(yīng)用雙向熒光差異凝膠電泳技術(shù)篩選3對肝癌組織(無血管侵犯、單發(fā)、腫瘤直徑5cm)及其配對癌旁組織間差異表達(dá)蛋白位點(diǎn),并使用質(zhì)譜鑒定。應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR(qPCR, n=59)、Westen blot免疫印跡(n=16)、免疫組化(n=265)等方法在臨床肝癌患者的腫瘤和配對癌旁組織中驗(yàn)證差異蛋白過氧化物酶6(Peroxiredoxin 6, PRDX6)的表達(dá)情況,并分析其與各臨床指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)合正常肝臟組織(n=42)和肝硬化組織(n=48)分析其在肝癌發(fā)生過程中的表達(dá)水平變化。同時收集15例正常人及40例肝癌患者血清,檢測PRDX6的血清學(xué)差異。2.應(yīng)用肝癌HepG2和BEL-7402細(xì)胞株進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),使用慢病毒以及siRNA干擾調(diào)控PRDX6在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平,通過集落形成、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)、CCK8增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)檢測PRDX6對腫瘤細(xì)胞各項(xiàng)功能的影響。使用H2O2、腫瘤壞死因子-α/放線菌酮(TNF-a/CHX)等試劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,檢測PRDX6在不同條件下對凋亡的影響,并使用鈣離子非依賴性磷脂酶A2(iPLA2)抑制劑-溴烯醇內(nèi)酯(BEL溶液)來鑒定PRDX6特定活性的作用。結(jié)果1.凝膠電泳及質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)8個蛋白在肝癌及配對癌旁組織中表達(dá)有顯著性差異,且差異倍數(shù)大于3,其中包括PRDX6蛋白,在癌旁組織中顯著高表達(dá)(p0.05)。肝癌組織Western blot、q-PCR及免疫組化檢測證實(shí)癌旁組織中PRDX6表達(dá)顯著升高(p0.05)。免疫組化結(jié)果同時還顯示,PRDX6在肝硬化組織中表達(dá)最低,正常肝組織中表達(dá)水平顯著高于肝硬化組織,但顯著低于癌旁組織(p0.05)。肝癌組織中的PRDX6水平與術(shù)前血清AFP、組織分化程度顯著相關(guān)(p0.05),癌旁組織中PRDX6水平與肝硬化、腫瘤個數(shù)和大血管侵犯顯著相關(guān)(p0.05)。145例肝癌隨訪研究發(fā)現(xiàn),肝癌組織PRDX6表達(dá)水平與預(yù)后不佳顯著相關(guān),且是肝癌預(yù)后的獨(dú)立評判因子(p0.05)。血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)PRDX6在肝癌患者血清中表達(dá)水平顯著高于正常人(p0.05)。2. PRDX6高表達(dá)能抑制集落形成及裸鼠移植瘤生長(p0.05)。PRDX6低表達(dá)能降低BEL-7402的增殖活性。HepG2中PRDX6過表達(dá)能增加S期、減少G2期細(xì)胞數(shù)量,PRDX6沉默在HepG2和BEL-7402細(xì)胞中得到對應(yīng)的相反結(jié)果.PRDX6過表達(dá)僅能在BEL-7402中增加細(xì)胞凋亡,而沉默后對凋亡無影響。H2O2誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的條件下,PRDX6過表達(dá)顯著減少HepG2和BEL-7402細(xì)胞的凋亡,沉默后能增加HepG2和BEL-7402細(xì)胞凋亡；TNF-α/CHX誘導(dǎo)凋亡的條件下,PRDX6過表達(dá)能增加HepG2和BEL-7402細(xì)胞的凋亡,沉默后能減少HepG2和BEL-7402細(xì)胞凋亡。TNF-a/CHX誘導(dǎo)凋亡的條件下,加入iPLA2抑制劑能減少細(xì)胞凋亡,且作用與PRDX6表達(dá)水平相關(guān)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn),TNF-a/CHX誘導(dǎo)凋亡條件下,PRDX6沉默能改變BAX、Caspase3和Caspase8的表達(dá)水平。結(jié)論1. PRDX6在肝癌血清及癌旁組織表達(dá)量升高,在肝硬化組織中表達(dá)量低,有望成為肝癌診斷、手術(shù)預(yù)后評判的重要分子標(biāo)記物。2. PRDX6在H202或TNF-α環(huán)境下對肝癌細(xì)胞凋亡有不同的作用,但在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中主要表現(xiàn)為抑制作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：1560255