本文選題：p53蛋白　切入點：MDM2蛋白　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：在乳腺癌的發(fā)展進(jìn)程中,p53蛋白的抑癌功能可能會受與其相互作用蛋白的影響而減弱。在這些相互作用的蛋白中,MDM2作為一個重要的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白能夠抑制p53的轉(zhuǎn)錄激活。因此,準(zhǔn)確定量并監(jiān)測在疾病狀態(tài)下p53-MDM2相互作用的改變情況,能夠進(jìn)一步理解蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI),同時也能為深入研究癌癥的發(fā)生發(fā)展、開發(fā)更先進(jìn)的治療手段提供參考依據(jù)。然而,近年來僅有少部分研究者從事了包括P53-MDM2相互作用在內(nèi)的關(guān)于PPI的定量研究。另外,目前的PPI的研究方法中常常很難同時具有高靈敏度與高特異性的優(yōu)點。因此,迫切需要發(fā)展一種同時具備高靈敏度(低假陰性率)和高特異性(低假陽性率)的PPI定量檢測方法。近年來,以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)為基礎(chǔ)的定向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)憑借其高靈敏度、高選擇性以及較寬的動態(tài)范圍等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于分子生物的研究領(lǐng)域。本研究中利用以LC-MS/MS為基礎(chǔ)的定向蛋白質(zhì)組學(xué)方法與免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)相結(jié)合,發(fā)展了一種全新的用于P53-MDM2相互作用的定量檢測方法。實驗結(jié)果表明,一種抗原表位在156-214位殘基的p53抗體免疫沉淀效果最好。接下來,分別選擇了 p53蛋白第321-333位氨基酸序列的多肽KPLDGEYFTLQIR以及MDM2蛋白第327-334位氨基酸序列的多肽ENWLPEDK,作為p53和MDM2在定量分析中的特征性肽段,以穩(wěn)定同位素標(biāo)記的合成肽段作為內(nèi)標(biāo),實驗得到的定量限為2ng/mL。另外,對乳腺癌細(xì)胞樣品(MCF-7,MCF-10A)及組織樣品(乳腺癌組織,乳腺癌旁組織)中p53蛋白、MDM2蛋白以及p53-MDM2蛋白復(fù)合物進(jìn)行了定量檢測,并與蛋白免疫印跡(western blotting)技術(shù)得到的結(jié)果進(jìn)行比較。最后,選用了nutlin-3作為PPI的抑制劑,定量檢測了在給予nutlin-3抑制劑后,不同時間下MCF-7細(xì)胞中p53-MDM2相互作用的變化情況。
[Abstract]:In the development of breast cancer, the suppressor function of p53 protein may be weakened by interacting proteins. MDM2, as an important negative regulatory protein, can inhibit the transcriptional activation of p53. Accurately quantifying and monitoring the changes of p53-MDM2 interaction in disease state can further understand protein-protein interaction in protein-protein interaction, and can also be used to further study the occurrence and development of cancer. However, in recent years, only a small number of researchers have done quantitative research on PPI, including the P53-MDM2 interaction. The current research methods of PPI often have the advantages of high sensitivity and high specificity. It is urgent to develop a high sensitivity (low false negative rate) and high specificity (low false positive rate) quantitative detection method for PPI. The directional proteomics technology based on LC-MS / MS has the advantages of high sensitivity, high selectivity and wide dynamic range. It is widely used in the field of molecular biology. In this study, we combined the LC-MS/MS based directional proteomics with the co-immunoprecipitation co-IP technique. A new method for quantitative detection of P53-MDM2 interaction has been developed. The results show that the immunoprecipitation of p53 antibody with an antigen epitope at the 156-214 residues is the best. The peptide KPLDGEYFTLQIR of the 321-333 amino acid sequence of p53 protein and ENWLPEDK of the 327-334 amino acid sequence of MDM2 protein were selected as the characteristic peptides of p53 and MDM2 in quantitative analysis, and the stable isotope labeled synthetic peptide was used as the internal standard. The quantitative limit was 2ng / mL. In addition, p53 protein / MDM2 protein and p53-MDM2 protein complex in breast cancer cell samples (MCF-7 / MCF-10A) and tissue samples (breast cancer tissues and adjacent breast cancer tissues) were quantitatively detected. The results obtained by Western blotting were compared with those obtained by Western blotting. Finally, nutlin-3 was selected as the inhibitor of PPI to quantitatively detect the changes of p53-MDM2 interaction in MCF-7 cells at different time after nutlin-3 inhibitor was given.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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本文編號：1560097