本文選題：舌鱗狀細(xì)胞癌　切入點(diǎn)：microRNAs　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)主要影響口腔、舌咽部、口咽部、喉部以及涎腺等各個(gè)方面的功能,在口腔的惡性腫瘤類型中處于第六名的位置。而在口腔頜面部中的惡性腫瘤中,口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)占了相當(dāng)大的比例,大約80%左右。雖然近幾年我們致力于OSCC的治療以及相關(guān)發(fā)病的機(jī)制研究,并且取得了一定程度上的進(jìn)展以及突破,但是在過去的幾十年期間,口腔鱗狀細(xì)胞癌病人的存活率卻始終沒有太過明顯的提升和改善,平均每年確診病例中死亡率仍可以達(dá)到50%甚至以上。舌鱗狀細(xì)胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)在口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)當(dāng)中最為好發(fā),具有較高的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率和增殖能力。TSCC通常會(huì)導(dǎo)致言語,咀嚼及吞咽功能障礙。雖然,TSCC的治療方案已經(jīng)取得了一定進(jìn)展,但TSCC的死亡率仍然很高。因此了解參與TSCC發(fā)展進(jìn)程的分子機(jī)制,尋找TSCC的治療靶點(diǎn),發(fā)現(xiàn)TSCC新的治療策略是有必要的。microRNA(miRNA)是一類非編碼、并且擁有較小分子量的RNA,它發(fā)揮作用的方式是通過結(jié)合其靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'untranslated region,3'UTR),在轉(zhuǎn)錄以后水平調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。近年有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),多種類型的miRNA分子通過沉默或者抑制癌基因表達(dá)的這種方式,從而參與到癌細(xì)胞生物程序的調(diào)控之中。已經(jīng)有研究證實(shí),miR-137在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。然而,miR-137在舌鱗狀細(xì)胞癌中的作用的尚不清楚。為明確miR-137對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)行為的調(diào)控作用,并初步探索其分子生物學(xué)機(jī)制。本研究中,檢測(cè)了舌鱗狀細(xì)胞癌組織及細(xì)胞中,miR-137的表達(dá)的相對(duì)水平,并通過這種細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-137 mimic或著scramble檢測(cè)細(xì)胞生物學(xué)行為的方式來改變。合成miR-137靶基因SP1的3'非編碼區(qū)(untranslated regions,UTR)并插入海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。細(xì)胞用miR-137 mimic或scramble和pGL3-SP1-3'UTR或MUT3'UTR共轉(zhuǎn)染48h,利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。從而探討MicroRNA-137對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌增殖、遷移和侵襲的影響及對(duì)其分子調(diào)控.機(jī)制的初步研究。方法第一部分:miR-137在舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)中的表達(dá)及表觀遺傳學(xué)對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞miR-137表達(dá)的調(diào)控。提取細(xì)胞總RNA,隨后反轉(zhuǎn)錄過程成為cDNA,然后用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)來做內(nèi)參,使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)組織和其相關(guān)對(duì)照的正常組織進(jìn)行一系列相關(guān)檢測(cè),舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)細(xì)胞系(SCC4,SCC1,UM1和Cal27)、正�？谇唤琴|(zhì)細(xì)胞NOK16B細(xì)胞系和正�？谇唤琴|(zhì)細(xì)胞(NHOK)miR-137表達(dá)。舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)細(xì)胞系SCC1,UM1采用DNA甲基化抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)又或者采用組蛋白脫乙酰酶抑制劑曲古霉素A(TSA)處理24 h。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)用來測(cè)定細(xì)胞處理后miRNA-137的基因表達(dá)。第二部分:miR-137通過靶基因SP1對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)細(xì)胞系SCC1生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。MTT試驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)來探討miR-137 mimics和scramble轉(zhuǎn)染舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)細(xì)胞系SCC1后對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的影響。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)測(cè)定舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)細(xì)胞系SCC1分別轉(zhuǎn)染miR-137 mimics,scramble后E-cadherin,N-catenin,Snail,Vimentin蛋白在舌鱗癌組織中的表達(dá)。靶向掃描(TargetScan)探究miR-137潛在的靶增殖基因。對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)細(xì)胞系SCC1用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-137 mimics組、scramble組轉(zhuǎn)染后SP1的表達(dá)。應(yīng)用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù),克隆SP1基因的3'UTR區(qū)并連接到熒光素酶報(bào)告基因載體PGL3-REPORT上。所構(gòu)建的新載體命名為pGL3-REPORT-SP1-3'UTR。利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-137和SP1基因的靶向關(guān)系。結(jié)果第一部分:用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)25組舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)組織和25組正常對(duì)照組,分別測(cè)定了 miR-137的表達(dá)。相對(duì)于正常對(duì)照組,TSCC組織中miR-137的表達(dá)下調(diào)。此外,我們也證明,與正�？谇唤琴|(zhì)細(xì)胞NOK16B細(xì)胞系和正�？谇唤琴|(zhì)細(xì)胞(NHOK)相比,舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)細(xì)胞系(SCC4,SCC1,UM1 和 Cal27)中 miR-137 表達(dá)下調(diào)(P0.001)。②TSCC細(xì)胞系SCC1,UM1用0.5,1.5及3μmol/L 5-Aza-CdR(腔角質(zhì)細(xì)胞甲基化抑制劑,5-氮雜-2'-脫氧胞苷,5-Aza-CdR)亦或是300 nmol/L的TSA(組蛋白脫乙酰酶抑制劑曲古霉素,TrichostatinA,TSA)處理24h。我們發(fā)現(xiàn)采用DNA甲基化抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-CdR),亦或是組蛋白脫乙酰酶抑制劑曲古霉素A(TSA)處理后的舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)細(xì)胞系SCC1,UM1中miR-137表達(dá)均上調(diào)。第二部分:①SCC1細(xì)胞系miR-137的表達(dá)量,轉(zhuǎn)染scramble組和miR-137 mimic組分別是0.6327±0.12、32.725±0.34(P0.001)。②MTT實(shí)驗(yàn)中,舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)細(xì)胞系SCC1轉(zhuǎn)染miR-137 mimics后,對(duì)細(xì)胞增殖的抑制能力相較于于對(duì)照組來說明顯的提升,且此種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)方面的意義(P0.05)。在集落形成實(shí)驗(yàn)當(dāng)中,舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)細(xì)胞系SCC1轉(zhuǎn)染miR-137 mimics組細(xì)胞集落數(shù)要明顯的低于轉(zhuǎn)染scramble組,而且此種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P0.05),這提示著miR-137的表達(dá)可以顯著的降低舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)細(xì)胞系SCC1細(xì)胞的增殖能力。③轉(zhuǎn)染miR-137 mimics組較轉(zhuǎn)染scramble組,上皮細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)志E-鈣粘蛋白的表達(dá)升高,間充質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)志N-鈣粘蛋白、波性蛋白及Snail的表達(dá)降低。這些結(jié)果提示,miR-137抑制SCC1細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,且此種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P0.05)。④我們通過細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論:舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)細(xì)胞系SCC1轉(zhuǎn)染miR-137 mimics組細(xì)胞數(shù)明顯低于轉(zhuǎn)染scramble組,且此種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P0.05),提示miR-137過表達(dá)能顯著降低舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)細(xì)胞系SCC1細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞劃痕試驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染miR-137 mimics組細(xì)胞的劃痕愈合速度較慢。提示miR-137過表達(dá)能有效的抑制細(xì)胞遷移能力,且此種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)方面的意義(P0.05)。⑤在實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)當(dāng)中我們可以看出,在SCC1 細(xì)胞中,pGL3-REPORT-SP1-3'UTR 與 scramble 共轉(zhuǎn)染組、pGL3-REPORT-SP1-3'UTR 與 miR-137 mimics 共轉(zhuǎn)染組、pGL3-REPORT-MUT 3'UTR 與 miR-137 mimics 共轉(zhuǎn)染組、pGL3-REPORT-MUT 3'UTR 與 scramble共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶相對(duì)表達(dá)量分別為0.97±0.07、0.47±0.06、0.97±0.08、0.98±0.09,說明miR-137抑制了野生型SP13'UTR載體的熒光素酶活性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在Western-blot檢測(cè)當(dāng)中,SCC1細(xì)胞,轉(zhuǎn)染miR-137 mimics組與轉(zhuǎn)染scramble組相比較,SP1蛋白的表達(dá)量明顯的降低。MTT實(shí)驗(yàn)中,SP1與miR-137 mimics共轉(zhuǎn)染組較control與scramble共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力明顯增高,且此種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)方面的意義(P0.05)。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)的相關(guān)檢測(cè)當(dāng)中,在SCC1細(xì)胞中,SP1與miR-137mimics共轉(zhuǎn)染組較control與scramble共轉(zhuǎn)染組,上皮細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)志E-鈣粘蛋白的表達(dá)降低,間充質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)志N-鈣粘蛋白、波性蛋白及Snail的表達(dá)升高。這些結(jié)果提示,miR-137通過SP1調(diào)控SCC1細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,且此種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P0.05)。結(jié)論1、相對(duì)于正常對(duì)照組織,舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)組織中miR-137的表達(dá)下調(diào)。與正�？谇唤琴|(zhì)細(xì)胞NOK16B細(xì)胞系和正�？谇唤琴|(zhì)細(xì)胞(NHOK)相比,在舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)細(xì)胞系(SCC4,SCC1,UM1和Cal27)中miR-137表達(dá)均下調(diào)。2、在舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)細(xì)胞系SCC1細(xì)胞中,miR-137表達(dá)受表觀遺傳學(xué)調(diào)控。3、MiR-137抑制舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)細(xì)胞系SCC1細(xì)胞的增殖能力、集落形成能力、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲和遷移能力。4、在舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)細(xì)胞系SCC1細(xì)胞中,MiR-137靶向于SP1,并通過SP1調(diào)控SCC1的增殖能力與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.86
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本文編號(hào)：1559252