本文關鍵詞： 肝細胞肝癌 微小RNA 增殖 凋亡 侵襲 轉(zhuǎn)移　出處：《重慶醫(yī)科大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景與目的肝細胞肝癌(hepataocellular carcinoma, HCC)是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,具有發(fā)病率高、預后差、侵襲性強等特點。深入研究肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制,試圖為肝癌的診治提供新的思路。MicroRNA(miRNA)是一類大小約為19-25bp的非編碼單鏈小分子RNA,在不破壞mRNA穩(wěn)定性的前提下通過與靶標基因mRNA 3'UTR完全或不完全互補配對,進而抑制或阻斷靶基因翻譯。miRNA具有高度時序性、保守性、組織特異性的特點,單一miRNA可調(diào)控多個靶基因,同時也可能一個靶基因受到多個miRNA的調(diào)控。通過大量肝癌組織與正常肝組織miRNA表達譜的比較發(fā)現(xiàn),其中有一部分]miRNA表達上調(diào),有一部分表達下調(diào),上調(diào)的miRNA可能起著促癌基因的作用,而表達下調(diào)的miRNA則可能起著抑癌基因的作用。篩查肝癌患者的miRNA譜,發(fā)現(xiàn)與正常肝組織對比,miRNA-30b、-30c、-30e等表達明顯下調(diào),特別是在已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌組織中,下調(diào)更甚,這提示miRNA-30家族表達下調(diào)與肝癌的形成可能有一定的聯(lián)系。目前miRNA-30家族成員在肝癌中的具體作用機制研究較少。其中,家族成員之一miRNA-30a-5p在其他腫瘤中常見報道,因此我們挑選miRNA-30a-5p為研究對象,檢測其對肝癌細胞SMCC-7721增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。方法1.采用RT-qPCR檢測miRNA-30a-5p在肝癌組織中與正常肝組織中的表達差異：2.采用RT-qPCR檢測miRNA-30a-5p在肝癌細胞株中與正常肝細胞株中的表達差異；3.采用轉(zhuǎn)染技術過表達肝癌細胞株內(nèi)miRNA-30a-5p的表達水平；4.采用CCK-8、流式細胞術、Transwell遷移侵襲實驗對miRNA-30a-5p進行體外功能分析,觀察過表達miRNA-30a-5p后肝癌細胞株的生物學行為變化；5.采用裸鼠成瘤實驗對miRNA-30a-5p進行體內(nèi)功能分析,觀察過表達miRNA-30a-5p后肝癌細胞對裸鼠成瘤的影響；6.采用生物學信息技術預測miRNA-30a-5p的靶標基因,Western Blot技術進行初步驗證。結(jié)果1.通過RT-qPCR分別檢測48例手術肝癌組織、相應癌旁組織標本及10例正常肝組織標本中miRNA-30a-5p的表達,發(fā)現(xiàn)miRNA-30a-5p在肝癌組織中的相對表達量(0.31367±0.0568)低于癌旁肝組織(0.61226±0.0954)、正常肝組織(1.0733±0.0412),差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05),RT-qPCR分別檢測7種肝癌細胞株SMCC-7721、Huh7.0、 HepG2、HCCLM3、HCCLM6、MHCC-97H、MHCC-97L及正常肝細胞株L02中miRNA-30a-5p的表達,發(fā)現(xiàn)miRNA-30a-5p在7種肝癌細胞株的相對表達量均低于正常肝細胞株,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)；2.通過轉(zhuǎn)染miRNA-30a-5p mimics入肝癌細胞株SMCC-7721細胞,CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)miRNA-30a-5p過表達后可以抑制SMCC-7721細胞的增殖能力(P0.05),流式細胞術顯示miRNA-30a-5p過表達促進了細胞凋亡,細胞周期出現(xiàn)了S期阻滯,Transwell遷移侵襲實驗表明,miRNA-30a-5p過表達可以抑制SMCC-7721細胞的體外遷移、侵襲能力(p0.05)；3.通過裸鼠成瘤實驗,觀察到肝癌細胞SMCC-7721在轉(zhuǎn)染miRNA-30-5p后,裸鼠皮下腫瘤的生長明顯減緩,與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白組相比較,腫瘤的大小、質(zhì)量減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),生物信息學技術預測miRNA-30a-5p的可能靶基因,并利用western blot技術初步驗證了DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3A (DNA methltransferase 3A)可能是miRNA-30a-5p的靶基因。結(jié)論miRNA-30a-5p可抑制肝癌細胞增殖、促進其凋亡,減弱其轉(zhuǎn)移、侵襲能力。
[Abstract]:Background and objective: hepatocellular carcinoma (hepataocellular, carcinoma, HCC) is one of the most common malignant tumor of the digestive system with high incidence rate, poor prognosis and aggressive characteristics. Research on the molecular mechanism of HCC development, trying to provide new ideas for the diagnosis and treatment of liver cancer.MicroRNA (miRNA) is a kind of size non encoding small single stranded RNA 19-25bp, without destroying the stability of mRNA by 3'UTR and the target gene mRNA complete or incomplete complementary, thereby inhibiting or blocking the translation of target genes.MiRNA sequence is highly conservative, and characteristics of tissue specificity, a single miRNA can regulate the expression of multiple target genes, but also may be a a target gene regulated by multiple miRNA. The spectrum comparison found through a large number of liver tissue and normal liver tissue miRNA expression, which is a part of]miRNA expression, a part of expression, Upregulation of miRNA may play a role in promoting cancer gene, and expression of miRNA may play a role of tumor suppressor genes. Screening in patients with hepatocellular carcinoma miRNA spectrum, compared with normal liver tissue, miRNA-30b, -30c, -30e gene expression was significantly decreased, especially in has occurred in metastatic HCC tissues, decreased so, suggesting that miRNA-30 family expression and hepatocellular carcinoma form a contact. Currently a member of the miRNA-30 family in hepatocellular carcinoma specific mechanism research. Among them, one of the family members of miRNA-30a-5p in other cancers commonly reported, so we choose miRNA-30a-5p as the research object, to detect the apoptosis of hepatoma cell SMCC-7721 proliferation, influence the invasion and metastasis. Methods 1. RT-qPCR was used to detect the different expression of miRNA-30a-5p in hepatocellular carcinoma tissues and normal liver tissues: 2. detected by RT-qPCR miRNA-30a-5p in hepatocellular carcinoma Cell lines and normal liver cell lines differentially expressed by 3.; transfection expression level in hepatocellular carcinoma cell line miRNA-30a-5p; 4. by CCK-8, flow cytometry, Transwell on the migration of miRNA-30a-5p in vitro functional analysis of invasion experiment, observed the changes of the biological behavior of hepatocellular carcinoma cell line miRNA-30a-5p in nude mice by 5. after expression; the miRNA-30a-5p function in vivo analysis of tumor experiment, observed after overexpression of miRNA-30a-5p hepatoma cells of nude mice the effect of the use of information technology; 6. biological predicted targets based on miRNA-30a-5p by Western, Blot technology was preliminarily verified. Results 1. by RT-qPCR were detected in 48 cases of liver cancer tissue, the expression of miRNA-30a-5p in adjacent tissues and 10 cases of normal liver tissues, found that the relative expression of miRNA-30a-5p in hepatocellular carcinoma tissues (0.31367 + 0.0568) below Liver cancer (0.61226 + 0.0954) and normal liver tissues (1.0733 + 0.0412), the difference was statistically significant (P0.05, RT-qPCR) were detected in 7 HCC cell lines SMCC-7721, Huh7.0, HepG2, HCCLM3, HCCLM6, MHCC-97H, MHCC-97L and miRNA-30a-5p expression in normal liver cell line L02, found that the relative expression of miRNA-30a-5p in 7 kinds of HCC cell lines is lower than the normal liver cell line, the difference was statistically significant (P0.05); 2. by transfection of miRNA-30a-5p mimics into SMCC-7721 cells of hepatocellular carcinoma cell line CCK-8, we found that miRNA-30a-5p overexpression could inhibit the proliferation of SMCC-7721 cells (P0.05), showed that overexpression of miRNA-30a-5p promotes cell apoptosis by flow cytometry surgery, cell cycle arrest in the S phase, Transwell showed that the migration and invasion experiments, overexpression of miRNA-30a-5p in vitro can inhibit SMCC-7721 cell migration, invasion (P0.05); 3. by naked Mouse xenograft experiments, observed in SMCC-7721 cells after transfection of miRNA-30-5p, tumor growth slowed down significantly, and empty plasmid transfection group, blank group compared with the tumor size, quality is reduced, the difference was statistically significant (P0.05), may be the target gene bioinformatics prediction miRNA-30a-5p, and using Western blot preliminary validation of the DNA methyltransferase 3A (DNA methltransferase 3A) may be the target gene of miRNA-30a-5p. Conclusion: miRNA-30a-5p can inhibit cell proliferation, promote apoptosis, decrease the metastasis, invasion.

【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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