本文關(guān)鍵詞： GnT-V C225 放療敏感性 EGFR β1-6糖鏈　出處：《南方醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景鼻咽癌在中國南方地區(qū)有著較高的發(fā)病率,嚴重影響當?shù)厝嗣竦纳钯|(zhì)量。放射治療是鼻咽癌的主要治療方式。愛必妥(Cetuximab,C225)是針對表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)的一種單克隆抗體,在鼻咽癌病人治療中,可以作為放療的增敏劑。糖基轉(zhuǎn)移酶N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶-V(GnT-V)能催化N-糖鏈的β1,6分支形成。GnT-V及其產(chǎn)物β1,6糖鏈分支參與了多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本課題組前期實驗證實:下調(diào)GnT-V的表達能增加鼻咽癌細胞對放療的敏感性。另有文獻證實:GnT-V可通過改變細胞膜表面受體上的β 1,6-糖鏈,影響信號活化傳導而導致化療耐藥或放療抵抗。由于GnT-V及其糖基化產(chǎn)物β 1,6-糖鏈能影響鼻咽癌的放療敏感性;細胞膜表面受體上N-糖鏈的改變能影響放療抵抗;且C225是針對EGFR的單克隆抗體,因此我們猜想:GnT-V可能通過調(diào)節(jié)EGFR上的糖基化水平,從而影響C225對鼻咽癌細胞的放療敏感性。研究目的探討GnT-V是否通過調(diào)節(jié)EGFR的N-糖鏈β-1,6分支結(jié)構(gòu)影響C225的放療增敏作用,通過本項目研究,進一步豐富C225放療增敏作用的分子機制。研究方法1.慢病毒轉(zhuǎn)染鼻咽癌細胞株CNE1和CNE2,干擾GnT-V表達。2.RNA提取及RT-PCR測mRNA表達。3.免疫印跡Western blot檢測蛋白質(zhì)表達4.凝集素實驗用PHA-L檢測總β1-6糖鏈表達。5.細胞功能學實驗檢測腫瘤細胞惡性行為學。6.裸鼠皮下成瘤實驗及分割放射治療。7.免疫組化用PHA-L測裸鼠皮下腫瘤β1-6糖鏈水平。8.統(tǒng)計學分析。結(jié)果1.構(gòu)建穩(wěn)定低表達GnT-V的鼻咽癌細胞株及檢測干擾效果用慢病毒為載體的shRNA干擾鼻咽癌細胞CNE1,CNE2中GnT-V的表達,建立穩(wěn)定低表達GnT-V細胞株。2.GnT-V聯(lián)合C225對鼻咽癌細胞放療的影響(1)測量鼻咽癌細胞中C225的半抑制濃度(IC50)CNE1和CNE2細胞中,測得C225的IC50值分別為:717μg/ml和1244μg/ml。有文獻指出:當藥物在細胞實驗中作為放療增敏劑時,其實際應(yīng)用濃度應(yīng)為IC50值的五分之一[1]。因此在本實驗中,C225作為鼻咽癌細胞放療增敏劑的實驗濃度分別為:143μg/ml和249μg/ml。無射線條件下,五分之一的IC50值濃度的C225,對CNE1與CNE2兩組細胞的增殖活性無影響。(2)下調(diào)GnT-V聯(lián)合C225能增加鼻咽癌細胞對放療的敏感性兩株鼻咽癌細胞各分為“放射組”、“下調(diào)+放射組”、“C225+放射組”、“下調(diào)+C225+放射組”。由克隆形成實驗、遷移劃痕實驗、增殖活性實驗及流式細胞實驗證實:“放射組”的克隆形成率、細胞存活率和遷移劃痕率最高,凋亡率最低;“下調(diào)+C225+放射組”克隆形成率、細胞存活率和遷移劃痕率最低,凋亡率最高。3.探討下調(diào)GnT-V增加C225的放療敏感性與EGFR上β1-6糖鏈的關(guān)系。(1)用苦馬豆堿(SW)抑制高表達GnT-V的CNE2細胞株上的β1-6糖鏈,隨后將細胞分為“放射組”,“放射+SW組”“放射+SW+C225組”。由克隆形成實驗、遷移劃痕實驗、增殖活性實驗證實:克隆形成能力、遷移能力以及細胞活力由高至低分別是:“放射組”,“放射+SW組”“放射+SW+C225組”。因此,β1-6糖鏈與C225的放療增敏相關(guān)。(2)CNE1,CNE2兩株細胞的各個實驗組中,EGFR的mRNA、蛋白水平均無統(tǒng)計學差異。但用凝集素實驗檢測各實驗組中β1-6糖鏈的水平發(fā)現(xiàn):“放射組”糖鏈水平最高,“放射+下調(diào)+C225組”水平最低。隨后用免疫沉淀方法驗證EGFR上的β1-6糖鏈,亦發(fā)現(xiàn):“放射組”中EGFR的β1-6糖鏈水平最高;“放射+下調(diào)+C225組”中EGFR的β1-6糖鏈水平最低。因此,GnT-V影響C225的放射增敏機制可能是由于改變了 EGFR上的β1-6糖鏈。4.下調(diào)GnT-V聯(lián)合C225在放療條件下對裸鼠成瘤的影響(1)裸鼠腫瘤生長速度,“放射組”的最快,“下調(diào)+C225+放射組”最慢。(2)免疫組化實驗用PHA-L測量裸鼠皮下腫瘤的β1,6糖鏈表達水平。發(fā)現(xiàn)實驗組中生長速度快的腫瘤中β1,6糖鏈的含量更高。5.GnT-V影響C225放療敏感性的可能信號通路探究EGFR下游PI3K/AKT通路發(fā)現(xiàn),各實驗組磷酸化PI3K和磷酸化AKT的水平不同。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),對射線更敏感的細胞,p-PI3K及p-AKT水平更低。結(jié)論1.靶向GnT-V的shRNA真核表達慢病毒可以顯著下調(diào)GnT-V的mRNA和蛋白表達。2.下調(diào)GnT-V能進一步增加C225的放療增敏效果。3.GnT-V影響C225的放療敏感性可能是通過改變EGFR上的β 1-6糖鏈。4.下調(diào)GnT-V聯(lián)合C225在放療條件下能減慢裸鼠腫瘤生長。5.GnT-V聯(lián)合C225影響放療敏感性可可與PI3K/AKT通路相關(guān)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.63
，

本文編號：1553853