本文關(guān)鍵詞： 胰腺癌 化療耐藥 長鏈非編碼RNA 競爭性內(nèi)源性RNA 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶μ3轉(zhuǎn)錄本2 let-7 表皮生長因子受體 預(yù)后　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景胰腺癌是一種臨床發(fā)現(xiàn)晚、惡性程度高和預(yù)后差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。流行病學(xué)資料表明,胰腺癌的5年總體生存率在7%以下,分別位居美國和我國惡性腫瘤死亡原因的第四位和第六位,并呈上升趨勢。手術(shù)切除是目前臨床上唯一可能治愈胰腺癌的方式,但根治性手術(shù)切除率僅為15-20%,絕大多數(shù)患者在初次就診時(shí)因腫瘤局部晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移已失去手術(shù)機(jī)會(huì)�；熓歉纳凭植窟M(jìn)展期及轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者預(yù)后的重要治療手段,然而胰腺癌患者易發(fā)生化療耐藥,以吉西他濱為基礎(chǔ)的單藥或聯(lián)合用藥方案并沒有大幅延長患者的總體生存時(shí)間。因此,尋找新的分子標(biāo)記物以提高胰腺癌的早期診斷率、深入探索耐藥的分子機(jī)制以提高胰腺癌的藥物治療效果,對(duì)于改善胰腺癌患者預(yù)后具有重要的意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度大于200個(gè)核苷酸而不能編碼蛋白質(zhì)的RNA,以其豐富的基因表達(dá)調(diào)控手段,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、自噬、化療耐藥、干細(xì)胞維持及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)等多個(gè)方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。同時(shí),鑒于lncRNA自身表達(dá)上的豐富性和組織表達(dá)上的特異性,腫瘤中表達(dá)失調(diào)的lncRNA可作為腫瘤早期診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。研究表明lncRNA在胰腺癌中表達(dá)失調(diào),并參與胰腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、自噬、干細(xì)胞維持及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種腫瘤生物學(xué)表型的調(diào)控。但是其在胰腺癌化療耐藥中的調(diào)控作用及機(jī)制仍不完全明確。因此,深入研究lncRNA在胰腺癌化療耐藥中的調(diào)控作用和機(jī)制,對(duì)于揭示胰腺癌化療耐藥的分子機(jī)制具有重要的意義。研究目的檢測lncRNA在胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株及親本株中的表達(dá)差異,構(gòu)建胰腺癌耐藥相關(guān)的競爭性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò);篩選調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中潛在關(guān)鍵性lncRNA,初步探索潛在關(guān)鍵性lncRNA調(diào)控胰腺癌細(xì)胞化療耐藥作用及機(jī)制;并檢測潛在關(guān)鍵性lncRNA在胰腺癌組織中的表達(dá),評(píng)估其與預(yù)后的價(jià)值。研究方法通過高通量基因芯片檢測胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株AsPC-1/GR和親本株AsPC-1中l(wèi)ncRNA、mRNA及microRNA的表達(dá)差異,建立耐藥相關(guān)lncRNA表達(dá)譜;通過生物信息學(xué)分析,構(gòu)建胰腺癌耐藥相關(guān)的競爭性內(nèi)源性RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò);篩選調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中潛在關(guān)鍵性lncRNA,并預(yù)測其參與調(diào)控化療耐藥的可能作用及機(jī)制;選取預(yù)測的潛在關(guān)鍵性lncRNA作為研究對(duì)象,利用原位雜交技術(shù)檢測其在180例臨床手術(shù)標(biāo)本中的表達(dá),評(píng)估潛在關(guān)鍵性lncRNA的表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性;在胰腺癌細(xì)胞中上調(diào)/下調(diào)潛在關(guān)鍵性lncRNA的表達(dá)水平,采用CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell法等探索潛在關(guān)鍵性lncRNA對(duì)胰腺癌細(xì)胞化療敏感性、增殖、凋亡、侵襲及遷移等的調(diào)控作用;構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)的潛在關(guān)鍵性lncRNA的胰腺癌細(xì)胞株,建立裸鼠移植瘤模型,評(píng)估其在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長和化療藥物治療的作用;通過RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)探索潛在關(guān)鍵性lncRNA調(diào)控化療耐藥的機(jī)制及其作用的靶基因,Western blot檢測關(guān)鍵性lncRNA及其靶基因所調(diào)控信號(hào)通路的變化情況。研究結(jié)果1、胰腺癌吉西他濱耐藥相關(guān)lncRNA表達(dá)譜的建立通過高通量lncRNA芯片檢測,發(fā)現(xiàn)在胰腺癌吉西他濱耐藥株AsPC-1/GR和其親本株AsPC-1之間有1897個(gè)耐藥相關(guān)lncRNA存在表達(dá)差異(fold change1.5,P0.05),其中963條lncRNAs表達(dá)升高和934條lncRNAs表達(dá)降低,而長鏈非編碼RNA谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶μ3轉(zhuǎn)錄本2(Homo sapiens glutathione S-transferase mu 3,transcript variant 2,non-coding RNA,NR_024537.1,GSTM3TV2)呈顯著性表達(dá)升高(fold change104.52);并以此構(gòu)建了胰腺癌耐藥相關(guān)的競爭性內(nèi)源性RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。2、生物信息學(xué)分析結(jié)果通過對(duì)耐藥相關(guān)的競爭性內(nèi)源性RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)lncRNA GSTM3TV2在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為潛在關(guān)鍵性lncRNA,其可能通過競爭性內(nèi)源性RNA機(jī)制,競爭性結(jié)合let-7,調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中GLO1、KLK6、LAT2、OLR1及PARM1等的表達(dá),從而介導(dǎo)胰腺癌化療耐藥的發(fā)生。3、LncRNA GSTM3TV2在胰腺癌組織中的表達(dá)檢測通過原位雜交法檢測lncRNA GSTM3TV2在180例胰腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)GSTM3TV2在胰腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P=0.000);而GSTM3TV2主要在細(xì)胞漿表達(dá),細(xì)胞核未見表達(dá)。胰腺癌組織中GSTM3TV2的表達(dá)水平與腫瘤的N分期(P= 0.007)和TNM分期(P= 0.003)存在顯著相關(guān)性。單因素生存分析,發(fā)現(xiàn)GSTM3TV2的表達(dá)水平(P=0.004)、腫瘤分化程度(P= 0.035)、T分期(P= 0.008)、N分期(P= 0.000)及TNM分期(P= 0.000)與患者預(yù)后相關(guān)。多因素生存分析發(fā)現(xiàn),腫瘤分化程度(Low)、TNM分期(Ⅱ/Ⅲ)及組織GSTM3TV2表達(dá)水平(High)是胰腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P 值分別為 P=0.008,HR=1.706,95%CI:1.147-2.537;P=0.003,HR=2.786,95%CI:1.149-5.470;P=0.036,HR=1.466,95%CI:1.025-2.096)。4、LncRNAGSTM3TV2對(duì)胰腺癌細(xì)胞惡性表型的調(diào)控作用體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在胰腺癌細(xì)胞AsPC-1、MIAPaCa-2中上調(diào)GSTM3TV2可降低胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱及白蛋白紫杉醇的化療敏感性,減少吉西他濱及白蛋白紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生的細(xì)胞凋亡,并促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移,抑制細(xì)胞凋亡等;反之,在胰腺癌細(xì)胞AsPC-1/GR、MIAPaCa-2/GR中抑制GSTM3TV2的表達(dá)則觀察到相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(P0.05)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),穩(wěn)定過表達(dá)GSTM3TV2的實(shí)驗(yàn)組促進(jìn)腫瘤的生長和降低腫瘤對(duì)吉西他濱及白蛋白紫杉醇治療的敏感性(P0.05)。5、LncRNA GSTM3TV2調(diào)控let-7的表達(dá)介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞化療耐藥實(shí)時(shí)定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),在胰腺癌細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)GSTM3TV2的表達(dá)后可顯著抑制或促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞中l(wèi)et-7的表達(dá)(P0.05)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染let-7 mimics和let-7結(jié)合位點(diǎn)野生型的GSTM3TV2載體質(zhì)粒顯著降低293A細(xì)胞中的熒光素酶活性(P0.05),而共轉(zhuǎn)染let-7 mimics和let-7結(jié)合位點(diǎn)突變型的GSTM3TV2載體質(zhì)粒對(duì)熒光素酶活性無影響,間接證明GSTM3TV2可與let-7相結(jié)合。RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組及轉(zhuǎn)染let-7結(jié)合位點(diǎn)突變型GSTM3TV2載體質(zhì)粒組相比,在胰腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染let-7結(jié)合位點(diǎn)野生型GSTM3TV2載體質(zhì)粒組中l(wèi)et-7的表達(dá)顯著升高(P0.05),直接證明GSTM3TV2可與let-7相結(jié)合。Western blot檢測顯示,在胰腺癌細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)GSTM3TV2的表達(dá)后上調(diào)或下調(diào)let-7靶基因K-Ras、c-Myc及HMGA2的表達(dá)水平,進(jìn)一步說明GSTM3TV2可調(diào)控胰腺癌細(xì)胞中l(wèi)et-7的表達(dá)水平。同時(shí),在穩(wěn)定過表達(dá)GSTM3TV2的胰腺癌細(xì)胞中促進(jìn)let-7的表達(dá),可顯著增加胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的化療敏感性(P0.05),并顯著增加細(xì)胞對(duì)吉西他濱誘導(dǎo)發(fā)生的凋亡(P0.05),抑制let-7靶基因K-Ras、c-Myc及HMGA2等的表達(dá),說明LncRNA GSTM3TV2調(diào)控胰腺癌細(xì)胞化療敏感性依賴于let-7的表達(dá)水平。6、LncRNAGSTM3TV2調(diào)控LAT2、OLR1的表達(dá)介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞化療耐藥Real time PCR檢測發(fā)現(xiàn),在胰腺癌耐藥細(xì)胞中下調(diào)GSTM3TV2的表達(dá)后可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞中LAT2、OLR1 mRNA的表達(dá)(P0.05)。Western blot檢測顯示,在胰腺癌細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)GSTM3TV2的表達(dá)后可促進(jìn)或抑制胰腺癌細(xì)胞中LAT2、OLR1在蛋白水平的表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)LAT2、OLR1為let-7的下游靶基因(P0.05),說明GSTM3TV2可通過競爭性結(jié)合let-7,從而調(diào)控LAT2、OLR1的表達(dá)。而在胰腺癌細(xì)胞中抑制LAT2、OLR1的表達(dá)后,可增加細(xì)胞對(duì)吉西他濱的化療敏感性(P0.05)和增加細(xì)胞對(duì)吉西他濱誘導(dǎo)發(fā)生的凋亡(P0.05),說明LAT2、OLR1可調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的化療敏感性。同時(shí),在GSTM3TV2穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞中抑制LAT2、OLR1的表達(dá),可增加細(xì)胞對(duì)吉西他濱的化療敏感性(P0.05)和增加細(xì)胞對(duì)吉西他濱誘導(dǎo)所發(fā)生的凋亡(P0.05),而Western blot檢測結(jié)果顯示過表達(dá)let-7可抑制GSTM3TV2穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞中LAT2、OLR1的表達(dá),說明GSTM3TV2可調(diào)控LAT2、OLR1的表達(dá)介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞化療耐藥的發(fā)生。7、LncRNAGSTM3TV2 調(diào)控let-7 的表達(dá)激活 PI3K/Akt、MAPK 及 STAT3 信號(hào)通路Western blot檢測顯示,在胰腺癌細(xì)胞中AsPC-1、MIAPaCa-2上調(diào)GSTM3TV2的表達(dá)后,可以①激活K-Ras基因下游的PI3K/Akt信號(hào)通路,從而上調(diào) p-mTOR、p-Akt、Bcl-xl、NF-κB、p-GSK-3β、p-Bad 和下調(diào) cleaved caspase-9、p21、p27等表達(dá),進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CyclinE1、CDK6,和下調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved PARP、cleaved caspase-3等的表達(dá);②激活K-Ras基因下游的MAPK信號(hào)通路而上調(diào)c-Raf、p-c-Raf、p-ERK1/2等表達(dá);③上調(diào)K-Ras基因下游蛋白分子Rac1、RhoA等表達(dá);④上調(diào)EMT相關(guān)蛋白Vimentin、N-cadherin,、ZEB1、Snail及 Slug 等表達(dá);⑤激活 STAT3 信號(hào)通路而上調(diào)p-STAT3的表達(dá)。反之,在胰腺癌細(xì)胞AsPC-1/GR、MIAPaCa-2/GR中抑制GSTM3TV2的表達(dá)則觀察到相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。8、LncRNAGSTM3TV2調(diào)控EGFR的表達(dá)降低胰腺癌細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的敏感性Western blot檢測顯示在胰腺癌細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)GSTM3TV2的表達(dá)可抑制或促進(jìn)EGFR的表達(dá);而Real time PCR檢測發(fā)現(xiàn),在胰腺癌細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)GSTM3TV2的表達(dá)可促進(jìn)或抑制EGFR mRNA的表達(dá),說明GSTM3TV2調(diào)控EGFR在蛋白水平的表達(dá)是在翻譯或翻譯前水平。RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),GSTM3TV2可直接結(jié)合EGFR的mRNA以阻礙翻譯過程,下調(diào)EGFR在蛋白水平的表達(dá)。而在胰腺癌細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)GSTM3TV2的表達(dá)可降低或增加胰腺癌細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的化療敏感性(P0.05),和抑制或促進(jìn)細(xì)胞對(duì)厄洛替尼誘導(dǎo)產(chǎn)生的凋亡(P0.05)。同時(shí),在GSTM3TV2穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞中促進(jìn)EGFR的表達(dá),可顯著增加胰腺癌細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的敏感性(P0.05)和細(xì)胞對(duì)厄洛替尼誘導(dǎo)發(fā)生的凋亡(P0.05),而Western blot顯示在上調(diào)EGFR的表達(dá)可拮抗GSTM3TV2對(duì)EGFR產(chǎn)生的抑制作用,說明LncRNA GSTM3TV2抑制EGFR的表達(dá)介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞對(duì)厄洛替尼耐藥的發(fā)生。結(jié)論長鏈非編碼RNA GSTM3TV2可通過競爭性內(nèi)源性RNA機(jī)制,競爭性結(jié)合let-7,上調(diào) let-7 的靶基因 K-Ras、c-Myc、HMGA2、LAT2 及 OLR1 等表達(dá),并激活PI3K/Akt、MAPK及STAT3信號(hào)通路,從而參與胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱化療耐藥的調(diào)控。LncRNA GSTM3TV2還可調(diào)控EGFR的表達(dá),從而介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的耐藥。LncRNA GSTM3TV2在胰腺癌組織中表達(dá)升高,GSTM3TV2表達(dá)升高是胰腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.9
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本文編號(hào)：1551873