本文關(guān)鍵詞： 脂氧素A4 調(diào)節(jié)性B細(xì)胞 白介素10 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞　出處：《華中科技大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：脂氧素(LXA4)在炎癥的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。LXA4同樣具有抗腫瘤作用。我們實驗室先前的研究發(fā)現(xiàn),LXA4能通過重塑腫瘤微環(huán)境和抗腫瘤血管生成來抑制肝癌腫瘤細(xì)胞的生長,但是其免疫學(xué)機(jī)制仍不是十分清楚。調(diào)節(jié)性B細(xì)胞,是一種能分泌IL-10的B細(xì)胞,已被證明在炎癥、自身免疫性疾病和腫瘤的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。最新的研究表明人和小鼠的B細(xì)胞上都有LXA4受體的表達(dá)。本研究旨在通過研究LXA4對調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的作用來闡明其抑制腫瘤生長的免疫學(xué)機(jī)制。 方法：(1)將不同的腫瘤細(xì)胞系通過皮下接種至小鼠,隨機(jī)分為兩組,其中一組腹腔注射LXA4類似物BML-111(1mg/kg)進(jìn)行治療,觀察并記錄腫瘤生長情況。此外,用CFSE標(biāo)記小鼠肝癌H22細(xì)胞,培養(yǎng)24h后,檢測LXA4對細(xì)胞生長的影響。(2)為尋找LXA4抑制腫瘤的機(jī)制,將肝癌H22細(xì)胞接種至SCID小鼠,并分為四組：對照組、LXA4治療組、CD3+T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移組、CD3+T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移+LXA4治療組,觀察并記錄腫瘤生長的情況。(3)為探討LXA4對調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的作用,體外條件下,分離小鼠脾臟B細(xì)胞,培養(yǎng)液中加入或不加LXA4,并在PMA、離子霉素、LPS和莫能菌素四種因子的刺激下,5h后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測LXA4對調(diào)節(jié)性B細(xì)胞生成的影響。體內(nèi)條件下,將LXA4治療的腫瘤小鼠的脾臟取出,比較治療組和對照組調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的數(shù)量。為探討LXA4對B細(xì)胞其他功能的作用,通過CFSE標(biāo)記、流式細(xì)胞術(shù)和HE染色的方法檢測LXA4對B細(xì)胞增殖、漿細(xì)胞分化以及生發(fā)中心結(jié)構(gòu)的影響。(4)將裸鼠皮下接種H22細(xì)胞,分為兩組,其中一組每兩天用LXA4治療一次,觀察并繪制腫瘤生長曲線,并通過流式細(xì)胞術(shù)和ELISA法檢測小鼠脾臟調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的數(shù)量及外周血、脾臟組織內(nèi)炎癥因子IL-6.TNF-α和IL-1β的蛋白表達(dá)情況。(5)將純化的CD4+T細(xì)胞標(biāo)記CFSE,檢測LXA4對其增殖的影響；將純化的CD8+T細(xì)胞用PMA和離子霉素刺激,檢測LXA4對其分泌IFN-γ能力的影響。(6)將H22細(xì)胞皮下接種至Balb/c小鼠,分為兩組,其中一組每兩天用LXA4治療一次,第15天取脾臟、接種腫瘤側(cè)引流淋巴結(jié)并分離腫瘤組織內(nèi)浸潤的淋巴細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量和CD8+T細(xì)胞的殺傷能力。并通過免疫組織化學(xué)的方法檢測腫瘤組織內(nèi)浸潤的T細(xì)胞的數(shù)量。(7)通過磁珠分選的方法將CD4+CD25-T細(xì)胞純化出來后,在刺激性抗體CD3和CD28以及細(xì)胞因子TGF-β和IL-2的作用下,72h后檢測LXA4對誘導(dǎo)生成的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量的影響。另外,將純化出來的CD4+T細(xì)胞與B細(xì)胞按照1：1的比例在CD3和LPS的作用下共培養(yǎng),72h后檢測LXA4能否通過B細(xì)胞影響誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成。(8)為尋找LXA4影響調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的分子機(jī)制,將LXA4治療小鼠的脾臟細(xì)胞或純化的B細(xì)胞提取蛋白質(zhì),并通過Western Blot的方法檢測轉(zhuǎn)錄因子ERK和STAT3的磷酸化水平。此外,體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞并加入ERK或STAT3的磷酸化抑制劑,5h后檢測調(diào)節(jié)性B細(xì)胞生成的情況。 結(jié)果：(1)LXA4類似物BML-111對多種不同的腫瘤細(xì)胞系都有抑制其在體內(nèi)生長的作用。此外,LXA4對腫瘤的生長沒有直接的影響。(2)與對照組相比,LXA4能夠促進(jìn)SCID小鼠的腫瘤生長；將CD3+T細(xì)胞過繼回輸至SCID小鼠體內(nèi)后,增強(qiáng)了抗腫瘤的效應(yīng),但是LXA4同樣也不影響腫瘤的生長。(3)LXA4在體外和體內(nèi)都能明顯抑制調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的生成,但是LXA4不影響B(tài)細(xì)胞的增殖、生發(fā)中心的結(jié)構(gòu)以及漿細(xì)胞的分化。(4)在裸鼠中,LXA4能明顯抑制調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的生成,同時降低了炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β的蛋白表達(dá),但是腫瘤在裸鼠中的生長并沒有受到影響。(5)LXA4不影響CD4+T細(xì)胞的增殖以及CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力。(6)LXA4抑制了引流淋巴結(jié)和腫瘤組織內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量,并增強(qiáng)了CD8+T細(xì)胞的殺傷能力,但是對脾臟中的這兩種細(xì)胞沒有影響；免疫組化的結(jié)果顯示LXA4增強(qiáng)了CD3+T細(xì)胞浸潤腫瘤的能力。(7)LXA4不能通過直接作用影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成,但是可以通過B細(xì)胞來抑制這種細(xì)胞的數(shù)量。(8)LXA4能有效地抑制B細(xì)胞而不是脾臟細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子ERK和STAT3的磷酸化水平。加入ERK或STAT3的磷酸化抑制劑后能有效地抑制調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的生成,說明這兩種轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化與調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的生成密切相關(guān)。 結(jié)論：LXA4能有效地抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長；LXA4對腫瘤細(xì)胞沒有直接作用,而是通過對調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的抑制從而增強(qiáng)了抗腫瘤效應(yīng)；LXA4通過抑制調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的生成從而減少了引流淋巴結(jié)和腫瘤組織內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量并增強(qiáng)了CD8+T細(xì)胞的殺傷能力；LXA4通過降低B細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子ERK和STAT3的磷酸化水平來抑制調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的生成。
[Abstract]:Objective: lipoxin (LXA4) in the regulation of inflammation plays an important role in.LXA4 also has anti-tumor effect. Previous studies have found that our laboratory, LXA4 can reshape the tumor microenvironment and anti angiogenesis to inhibit the growth of tumor cells, but the immune mechanism is not very clear regulatory B. Cell is a IL-10 secreted by B cells, has been shown to play an important role in the regulation of inflammation, autoimmune diseases and tumors. Recent studies show that human and mouse B cells have the expression of LXA4 receptor. This study aims at through the study of LXA4 on regulatory B cells to clarify the immunological mechanism of inhibiting tumor growth.
Methods: (1) the different tumor cell lines by subcutaneous inoculation into mice, were randomly divided into two groups, one group received intraperitoneal injection of LXA4 analogue BML-111 (1mg/kg) treatment, observe and record the growth of tumors. In addition, using mouse hepatoma H22 cell marker CFSE, 24h after culture, to study the effect of LXA4 on cell growth. (2) to find the mechanism of LXA4 inhibiting tumor, the hepatocellular carcinoma H22 cells inoculated to SCID mice were divided into four groups: control group, LXA4 treatment group, CD3+T cell adoptive transfer CD3+T cells adoptive transfer group, +LXA4 treatment group, observe and record the tumor growth. (3) to investigate the effect of LXA4 on regulatory B cells, in vitro, isolated from mouse spleen B cells, cultured in the presence or absence of LXA4, and in PMA, ionomycin, LPS and monensin four factors under the stimulation of 5h cells by flow cytometry to detect the LXA4 on the generation of regulatory B cells the shadow Ring. In vivo, the treatment of LXA4 tumor in mice spleen removed, the number of treatment group compared with control group of regulatory B cells. To investigate the effect of LXA4 on B cells of other functions, through the method of CFSE labeling, flow cytometry and HE staining of LXA4 on the proliferation of B cells and plasma cell differentiation effect of germinal center structure. (4) the nude mice were inoculated with H22 cells, divided into two groups, one group every two days of treatment with LXA4 at a time, to observe and draw tumor growth curve, and by mouse spleen cells was detected by flow cytometry and ELISA regulatory B cells in peripheral blood and the number of the expression of inflammatory cytokines in spleen tissue, IL-6.TNF- alpha and IL-1 beta protein. (5) the CD4+T cell marker CFSE purification, detection effect of LXA4 on cell proliferation; purified CD8+T cell stimulated by PMA and ionomycin, affect the detection of LXA4 IFN- secretion on the ability of the H22 (6). Cells were inoculated subcutaneously into Balb/c mice, divided into two groups, one group by LXA4 every two days for a fifteenth day from spleen inoculation side of tumor draining lymph node and tumor infiltrating lymphocytes isolated from tissues of regulatory T cells by flow cytometry and the number of CD8+T cell killing ability. And the invasion of T cells by immunohistochemistry in tumor tissue. (7) through the method of sorted CD4+CD25-T cells were purified, CD3 and CD28 in stimulating antibody and cytokine TGF- beta and IL-2, to study the effect of LXA4 on the number of regulatory T cells induced by 72h. In addition, the purified CD4+T cells and B cells according to the ratio of 1:1 in CD3 and LPS under the effect of co culture, 72h can detect LXA4 regulatory T cells generated by B cells induced by LXA4. (8) for effect The molecular mechanism of regulatory B cells, LXA4 treated mice spleen cells or purified B cell protein was extracted by Western method, and the detection of Blot transcription factor ERK and phosphorylation of STAT3. In addition, phosphorylation inhibitor in vitro induction of regulatory B cells with ERK or STAT3, detection of regulatory B cells the generation of 5h.
Results: (1) tumor cell line LXA4 analogue BML-111 on different have inhibited the in vivo growth. In addition, LXA4 on tumor growth has no direct effect. (2) compared with the control group, LXA4 SCID can promote tumor growth in mice; CD3+T cells adoptive infusion into SCID mice in vivo, enhanced anti-tumor effect, but LXA4 also did not affect tumor growth. (3) LXA4 can significantly inhibit the generation of regulatory B cells in vitro and in vivo, but LXA4 does not affect the proliferation of B cells in germinal center structure and plasma cell differentiation in nude mice (4). In LXA4 can obviously inhibit the generation of regulatory B cells, and reduce the inflammatory factor IL-6, expression of TNF- alpha and IL-1 beta protein, but the tumor growth in nude mice was not affected. (5) the ability of LXA4 does not affect the proliferation of CD4+T cells and CD8+T cells to secrete IFN-. ( 6) LXA4 inhibited the drainage quantity of regulatory T cells in tumor tissue and lymph nodes, and enhanced CD8+T cell killing ability, but has no effect on these two kinds of cells in the spleen; immunohistochemistry results showed that LXA4 enhanced the ability of CD3+T cells to tumor invasion. (7) do not produce the LXA4 regulation T cells by direct effect, but the number can be through B cell to inhibit this cell. (8) LXA4 can effectively inhibit B cells and transcription factor ERK and STAT3 cells in the spleen phosphorylation. Phosphorylation inhibitor with ERK or STAT3 can effectively inhibit the generation of regulatory B cells, indicating that these two transcription factor phosphorylation is closely related with the generation of regulatory B cells.
Conclusion: LXA4 can effectively inhibit tumor cell growth; LXA4 has no direct effect on tumor cells, but through inhibition of regulatory B cells to enhance the anti-tumor effect; LXA4 by inhibiting the generation of regulatory B cells in order to reduce the drainage of lymph node in tumor tissue and the number of regulatory T cells and enhanced the CD8+T cell killing ability; LXA4 by reducing the transcription factor ERK and STAT3 in B cells to inhibit the phosphorylation of generation of regulatory B cells.

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2

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本文編號：1550120