本文關鍵詞： CdSe@ZnS量子點 納米材料 熒光 純化 腫瘤標志物 高效尺寸排阻色譜法 靶向成像 生物探針　出處：《武漢大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：量子點是具有優(yōu)異光學性能的無機半導體納米晶,具有熒光量子產率高、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、光穩(wěn)定性好等優(yōu)點。量子點已廣泛應用于傳感、標記、成像和示蹤等生物醫(yī)學領域。過去的二十年文獻報道中,量子點主要由化學合成和生物合成策略得到。然而,迄今為止,高質量的CdSe@ZnS量子點是在有機相中通過化學合成法獲得,而疏水CdSe@ZnS量子點首先需要進行水溶性化修飾和生物功能化,然后才能用于生物醫(yī)學領域。量子點的水溶性化修飾主要有疏水包覆和配體交換兩種策略,用兩親性聚合物分子通過疏水包覆的方法可較好地保持量子點的熒光性能,所以本文選用此法。無論是其表面修飾或隨后的生物功能化過程,都要引入一些過量的修飾分子,在這些雜質中,量子點生物探針的一些膠體雜質會影響其性能,又難于用簡單的純化方法除盡,所以對親水性量子點和量子點標記抗體探針進行純化是保證量子點能夠提供可靠成像信息的先決條件。在目前文獻報道的量子點純化方法中,高效尺寸排阻色譜是很有效的分離純化方法。本文通過優(yōu)化高效尺寸排阻色譜實驗條件,得到比文獻報道的單分散CdSe@ZnS量子點標記抗體探針和膠體雜質之間更高的分離度,除去了親水CdSe@ZnS量子點和量子點標記抗體探針中的主要膠體雜質。經色譜純化的親水性量子點和量子點標記抗體探針在應用中更具有優(yōu)勢。在構建量子點熒光探針過程中,純化是減少產品中雜質的關鍵步驟。包括高效尺寸排阻色譜法、超速離心法、超濾法、透析法等都曾被用于量子點的純化。與其他依靠溶質和固定相的相互作用實現(xiàn)分離的色譜方法不同,高效尺寸排阻色譜法是根據樣品尺寸大小進行分離的,屬于“分子篩效應”,樣品與固定相之間無特異性相互作用,所以高效尺寸排阻色譜法具有操作條件溫和、回收率高、能最大程度上保持生物分子活性的優(yōu)勢。由于上述優(yōu)點,高效尺寸排阻色譜法已廣泛用于蛋白質、聚合物等大分子物質以及納米材料等的分離。因此,本論文將高效尺寸排阻色譜法用于親水性CdSe@ZnS量子點以及量子點標記抗體熒光探針的純化。首先,我們將疏水CdSe@ZnS量子點用辛胺接枝的聚丙烯酸進行修飾,團聚的聚丙烯酸修飾的量子點和多余的修飾材料用高效尺寸排阻色譜法除去,得到單分散的表面羧基的CdSe@ZnS量子點。然后對單分散的表面羧基量子點進行聚乙二醇修飾,再將表面帶有胺基的聚乙二醇修飾的量子點與鏈霉親和素(streptavidin, SA)或抗體(Immunoglobulin G, IgG)進行共價偶聯(lián),得到QD-SA或QD-IgG偶聯(lián)復合物。因為未參加反應的生物分子和量子點的懸浮團聚物也混入量子點與蛋白的偶聯(lián)復合物中,而且量子點的懸浮團聚物與單分散的量子點標記抗體探針性質差別小,不容易采用簡單的純化方法分開,量子點的懸浮團聚物對單分散的量子點生物探針的膠體穩(wěn)定性具有破壞作用,而且在對切片上腫瘤標志物檢測的實驗中會帶來非特異性吸附,所以必須將量子點標記抗體探針中的懸浮團聚物除去。由于量子點與蛋白的復合物與修飾量子點的蛋白之間性質差異小而難于完全將兩者分離,所以制備單分散的量子點生物熒光探針仍然是個難題。我們采用高效尺寸排阻色譜法除去了量子點懸浮團聚物、多余未反應的鏈霉親和素或抗體分子,得到單分散的量子點熒光探針用于乳腺癌腫瘤組織切片上腫瘤標志物的檢測。這些結果顯示經高效尺寸排阻色譜法純化得到的量子點熒光探針特異性更強。CdSe@ZnS量子點是一種量子點的“老成員”,因此適合將其用做構建一個高效尺寸排阻色譜法為基礎的純化方法的模型。經過在色譜流動相中加入適當濃度的氯化鈉,降低流速,多根色譜柱串起來以增加柱長等色譜條件的優(yōu)化,加上高效尺寸排阻色譜法有重復性好、回收率高的優(yōu)勢,實現(xiàn)了膠體雜質和單分散的親水性量子點和量子點標記抗體探針的制備。該方法有望作為一種標準的純化方法推廣到其他種類的納米材料的分離純化中。本論文嘗試用高效尺寸排阻色譜法純化親水性CdSe@ZnS量子點以及CdSe@ZnS量子點生物探針,具體內容如下：1.用辛胺接枝的聚丙烯酸對量子點進行水溶性化修飾,用高效尺寸排阻色譜法除去多余的修飾材料OPA和量子點的懸浮團聚物,純化得到的單分散的表面羧基的量子點至少在一年內保持了良好的膠體穩(wěn)定性。表面羧基的CdSe@ZnS量子點和兩端胺基的聚乙二醇進行偶聯(lián),得到表面胺基的聚乙二醇修飾的量子點。2.表面胺基的聚乙二醇修飾的量子點分別與SA或與二抗IgG進行偶聯(lián),分別形成QD-SA與QD-IgG。未反應的生物功能修飾分子和量子點的懸浮團聚物被從新制備的偶聯(lián)復合物中除去,得到單分散的QD-SA或QD-IgG。將單分散的探針用于檢測乳腺癌腫瘤組織切片上的腫瘤標志物高分子量細胞角蛋白(high molecular weight cytokeratin, CK34βE12)、E-鈣粘附蛋白(E-cadherine, E-cad)和p120連環(huán)蛋白(p120 catenin, p120)。純化得到的量子點熒光探針顯示了特異性的陽性信號而無非特異性信號。因此,結合高效尺寸排阻色譜法在內的一系列純化操作,是有效的、具有普適性的純化方法,用于收集得到單分散的量子點熒光探針,這對生物醫(yī)學應用是非常重要的。腫瘤標志物分子的檢測結果與傳統(tǒng)的免疫組化法結果一致。3.用表面胺基的聚乙二醇修飾的量子點與巰基化修飾的抗HER2的小鼠抗人抗體進行偶聯(lián),并將此偶聯(lián)復合物用高效尺寸排阻色譜法進行純化,未偶聯(lián)的抗體和量子點懸浮團聚物從新制備的偶聯(lián)復合物中除去,得到單分散的量子點和HER2抗體的復合物(QD-HER2-Ab),并將其用做體內瘤體靶向成像的熒光探針。將純化的QD-HER2-Ab探針按相對裸鼠體重15 nmol·kg-1的劑量經尾靜脈注射到裸鼠體內,對養(yǎng)7天之后的裸鼠進行觀察,未發(fā)現(xiàn)明顯的急性中毒癥狀,而且顯示了QD-HER2-Ab探針在瘤體靶向特異性的成像能力。在乳腺癌異種種植的腫瘤動物模型中(注射后24小時),注射經高效尺寸排阻色譜法純化的QD-HER2-Ab探針和未純化探針的荷瘤裸鼠的肝臟中,殘余鎘的濃度分別為8.3 ng·kg-1和56.7 ng·kg-1。高效尺寸排阻色譜法純化后的QD-HER2-Ab探針未導致注射組裸鼠主要內臟器官的炎性癥狀,評價肝、腎功能的幾項血液生化指標也都在正常的水平。由于注射了色譜法純化得到的QD-HER2-Ab的裸鼠外周血和肝臟中殘余的量子點濃度降低,成像背景降低,所以其瘤體靶向成像的特異性增加。高效尺寸排阻色譜法純化后的QD-HER2-Ab探針提供了一種精準的乳腺癌瘤體靶向成像和HER2體內、體外檢測的納米熒光材料,同時也為其他類型量子點探針的純化提供借鑒。隨后我們制備了量子點和抗甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)抗體的偶聯(lián)復合物(QD-AFP-Ab),并按上述方法純化,經高效尺寸排阻色譜法純化得到的QD-AFP-Ab用于異種種植的肝癌皮下瘤動物模型的瘤體靶向成像,LM9細胞作為成瘤的細胞。用高效尺寸排阻色譜法純化得到的QD-AFP-Ab探針能特異性地實現(xiàn)對荷肝癌皮下瘤裸鼠活體中的瘤體靶向成像�？傊�,本論文以高效尺寸排阻色譜法為關鍵技術,重點研究了親水性CdSe@ZnS量子點與CdSe@ZnS量子點標記抗體探針的純化方法,原位靶向成像結果表明：純化之后的單分散的量子點標記抗體探針探針在體外、體內腫瘤標志物檢測中具有明顯優(yōu)勢。
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【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：O657;R730.43
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本文編號：1550118