本文關(guān)鍵詞： CdSe@ZnS量子點(diǎn) 納米材料 熒光 純化 腫瘤標(biāo)志物 高效尺寸排阻色譜法 靶向成像 生物探針　出處：《武漢大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：量子點(diǎn)是具有優(yōu)異光學(xué)性能的無(wú)機(jī)半導(dǎo)體納米晶,具有熒光量子產(chǎn)率高、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、光穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。量子點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于傳感、標(biāo)記、成像和示蹤等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。過(guò)去的二十年文獻(xiàn)報(bào)道中,量子點(diǎn)主要由化學(xué)合成和生物合成策略得到。然而,迄今為止,高質(zhì)量的CdSe@ZnS量子點(diǎn)是在有機(jī)相中通過(guò)化學(xué)合成法獲得,而疏水CdSe@ZnS量子點(diǎn)首先需要進(jìn)行水溶性化修飾和生物功能化,然后才能用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。量子點(diǎn)的水溶性化修飾主要有疏水包覆和配體交換兩種策略,用兩親性聚合物分子通過(guò)疏水包覆的方法可較好地保持量子點(diǎn)的熒光性能,所以本文選用此法。無(wú)論是其表面修飾或隨后的生物功能化過(guò)程,都要引入一些過(guò)量的修飾分子,在這些雜質(zhì)中,量子點(diǎn)生物探針的一些膠體雜質(zhì)會(huì)影響其性能,又難于用簡(jiǎn)單的純化方法除盡,所以對(duì)親水性量子點(diǎn)和量子點(diǎn)標(biāo)記抗體探針進(jìn)行純化是保證量子點(diǎn)能夠提供可靠成像信息的先決條件。在目前文獻(xiàn)報(bào)道的量子點(diǎn)純化方法中,高效尺寸排阻色譜是很有效的分離純化方法。本文通過(guò)優(yōu)化高效尺寸排阻色譜實(shí)驗(yàn)條件,得到比文獻(xiàn)報(bào)道的單分散CdSe@ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記抗體探針和膠體雜質(zhì)之間更高的分離度,除去了親水CdSe@ZnS量子點(diǎn)和量子點(diǎn)標(biāo)記抗體探針中的主要膠體雜質(zhì)。經(jīng)色譜純化的親水性量子點(diǎn)和量子點(diǎn)標(biāo)記抗體探針在應(yīng)用中更具有優(yōu)勢(shì)。在構(gòu)建量子點(diǎn)熒光探針過(guò)程中,純化是減少產(chǎn)品中雜質(zhì)的關(guān)鍵步驟。包括高效尺寸排阻色譜法、超速離心法、超濾法、透析法等都曾被用于量子點(diǎn)的純化。與其他依靠溶質(zhì)和固定相的相互作用實(shí)現(xiàn)分離的色譜方法不同,高效尺寸排阻色譜法是根據(jù)樣品尺寸大小進(jìn)行分離的,屬于“分子篩效應(yīng)”,樣品與固定相之間無(wú)特異性相互作用,所以高效尺寸排阻色譜法具有操作條件溫和、回收率高、能最大程度上保持生物分子活性的優(yōu)勢(shì)。由于上述優(yōu)點(diǎn),高效尺寸排阻色譜法已廣泛用于蛋白質(zhì)、聚合物等大分子物質(zhì)以及納米材料等的分離。因此,本論文將高效尺寸排阻色譜法用于親水性CdSe@ZnS量子點(diǎn)以及量子點(diǎn)標(biāo)記抗體熒光探針的純化。首先,我們將疏水CdSe@ZnS量子點(diǎn)用辛胺接枝的聚丙烯酸進(jìn)行修飾,團(tuán)聚的聚丙烯酸修飾的量子點(diǎn)和多余的修飾材料用高效尺寸排阻色譜法除去,得到單分散的表面羧基的CdSe@ZnS量子點(diǎn)。然后對(duì)單分散的表面羧基量子點(diǎn)進(jìn)行聚乙二醇修飾,再將表面帶有胺基的聚乙二醇修飾的量子點(diǎn)與鏈霉親和素(streptavidin, SA)或抗體(Immunoglobulin G, IgG)進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián),得到QD-SA或QD-IgG偶聯(lián)復(fù)合物。因?yàn)槲磪⒓臃磻?yīng)的生物分子和量子點(diǎn)的懸浮團(tuán)聚物也混入量子點(diǎn)與蛋白的偶聯(lián)復(fù)合物中,而且量子點(diǎn)的懸浮團(tuán)聚物與單分散的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體探針性質(zhì)差別小,不容易采用簡(jiǎn)單的純化方法分開(kāi),量子點(diǎn)的懸浮團(tuán)聚物對(duì)單分散的量子點(diǎn)生物探針的膠體穩(wěn)定性具有破壞作用,而且在對(duì)切片上腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)中會(huì)帶來(lái)非特異性吸附,所以必須將量子點(diǎn)標(biāo)記抗體探針中的懸浮團(tuán)聚物除去。由于量子點(diǎn)與蛋白的復(fù)合物與修飾量子點(diǎn)的蛋白之間性質(zhì)差異小而難于完全將兩者分離,所以制備單分散的量子點(diǎn)生物熒光探針仍然是個(gè)難題。我們采用高效尺寸排阻色譜法除去了量子點(diǎn)懸浮團(tuán)聚物、多余未反應(yīng)的鏈霉親和素或抗體分子,得到單分散的量子點(diǎn)熒光探針用于乳腺癌腫瘤組織切片上腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。這些結(jié)果顯示經(jīng)高效尺寸排阻色譜法純化得到的量子點(diǎn)熒光探針特異性更強(qiáng)。CdSe@ZnS量子點(diǎn)是一種量子點(diǎn)的“老成員”,因此適合將其用做構(gòu)建一個(gè)高效尺寸排阻色譜法為基礎(chǔ)的純化方法的模型。經(jīng)過(guò)在色譜流動(dòng)相中加入適當(dāng)濃度的氯化鈉,降低流速,多根色譜柱串起來(lái)以增加柱長(zhǎng)等色譜條件的優(yōu)化,加上高效尺寸排阻色譜法有重復(fù)性好、回收率高的優(yōu)勢(shì),實(shí)現(xiàn)了膠體雜質(zhì)和單分散的親水性量子點(diǎn)和量子點(diǎn)標(biāo)記抗體探針的制備。該方法有望作為一種標(biāo)準(zhǔn)的純化方法推廣到其他種類的納米材料的分離純化中。本論文嘗試用高效尺寸排阻色譜法純化親水性CdSe@ZnS量子點(diǎn)以及CdSe@ZnS量子點(diǎn)生物探針,具體內(nèi)容如下：1.用辛胺接枝的聚丙烯酸對(duì)量子點(diǎn)進(jìn)行水溶性化修飾,用高效尺寸排阻色譜法除去多余的修飾材料OPA和量子點(diǎn)的懸浮團(tuán)聚物,純化得到的單分散的表面羧基的量子點(diǎn)至少在一年內(nèi)保持了良好的膠體穩(wěn)定性。表面羧基的CdSe@ZnS量子點(diǎn)和兩端胺基的聚乙二醇進(jìn)行偶聯(lián),得到表面胺基的聚乙二醇修飾的量子點(diǎn)。2.表面胺基的聚乙二醇修飾的量子點(diǎn)分別與SA或與二抗IgG進(jìn)行偶聯(lián),分別形成QD-SA與QD-IgG。未反應(yīng)的生物功能修飾分子和量子點(diǎn)的懸浮團(tuán)聚物被從新制備的偶聯(lián)復(fù)合物中除去,得到單分散的QD-SA或QD-IgG。將單分散的探針用于檢測(cè)乳腺癌腫瘤組織切片上的腫瘤標(biāo)志物高分子量細(xì)胞角蛋白(high molecular weight cytokeratin, CK34βE12)、E-鈣粘附蛋白(E-cadherine, E-cad)和p120連環(huán)蛋白(p120 catenin, p120)。純化得到的量子點(diǎn)熒光探針顯示了特異性的陽(yáng)性信號(hào)而無(wú)非特異性信號(hào)。因此,結(jié)合高效尺寸排阻色譜法在內(nèi)的一系列純化操作,是有效的、具有普適性的純化方法,用于收集得到單分散的量子點(diǎn)熒光探針,這對(duì)生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用是非常重要的。腫瘤標(biāo)志物分子的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的免疫組化法結(jié)果一致。3.用表面胺基的聚乙二醇修飾的量子點(diǎn)與巰基化修飾的抗HER2的小鼠抗人抗體進(jìn)行偶聯(lián),并將此偶聯(lián)復(fù)合物用高效尺寸排阻色譜法進(jìn)行純化,未偶聯(lián)的抗體和量子點(diǎn)懸浮團(tuán)聚物從新制備的偶聯(lián)復(fù)合物中除去,得到單分散的量子點(diǎn)和HER2抗體的復(fù)合物(QD-HER2-Ab),并將其用做體內(nèi)瘤體靶向成像的熒光探針。將純化的QD-HER2-Ab探針按相對(duì)裸鼠體重15 nmol·kg-1的劑量經(jīng)尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi),對(duì)養(yǎng)7天之后的裸鼠進(jìn)行觀察,未發(fā)現(xiàn)明顯的急性中毒癥狀,而且顯示了QD-HER2-Ab探針在瘤體靶向特異性的成像能力。在乳腺癌異種種植的腫瘤動(dòng)物模型中(注射后24小時(shí)),注射經(jīng)高效尺寸排阻色譜法純化的QD-HER2-Ab探針和未純化探針的荷瘤裸鼠的肝臟中,殘余鎘的濃度分別為8.3 ng·kg-1和56.7 ng·kg-1。高效尺寸排阻色譜法純化后的QD-HER2-Ab探針未導(dǎo)致注射組裸鼠主要內(nèi)臟器官的炎性癥狀,評(píng)價(jià)肝、腎功能的幾項(xiàng)血液生化指標(biāo)也都在正常的水平。由于注射了色譜法純化得到的QD-HER2-Ab的裸鼠外周血和肝臟中殘余的量子點(diǎn)濃度降低,成像背景降低,所以其瘤體靶向成像的特異性增加。高效尺寸排阻色譜法純化后的QD-HER2-Ab探針提供了一種精準(zhǔn)的乳腺癌瘤體靶向成像和HER2體內(nèi)、體外檢測(cè)的納米熒光材料,同時(shí)也為其他類型量子點(diǎn)探針的純化提供借鑒。隨后我們制備了量子點(diǎn)和抗甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)抗體的偶聯(lián)復(fù)合物(QD-AFP-Ab),并按上述方法純化,經(jīng)高效尺寸排阻色譜法純化得到的QD-AFP-Ab用于異種種植的肝癌皮下瘤動(dòng)物模型的瘤體靶向成像,LM9細(xì)胞作為成瘤的細(xì)胞。用高效尺寸排阻色譜法純化得到的QD-AFP-Ab探針能特異性地實(shí)現(xiàn)對(duì)荷肝癌皮下瘤裸鼠活體中的瘤體靶向成像。總之,本論文以高效尺寸排阻色譜法為關(guān)鍵技術(shù),重點(diǎn)研究了親水性CdSe@ZnS量子點(diǎn)與CdSe@ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記抗體探針的純化方法,原位靶向成像結(jié)果表明：純化之后的單分散的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體探針探針在體外、體內(nèi)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中具有明顯優(yōu)勢(shì)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：O657;R730.43
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本文編號(hào)：1550118