本文關(guān)鍵詞： FAT4 胃癌 腫瘤轉(zhuǎn)移 Wnt/β-catenin 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 胃癌 表達(dá)芯片 加權(quán)基因共表達(dá)分析 生存分析 進(jìn)展期胃癌 D2淋巴結(jié)清掃 腹腔鏡輔助胃切除術(shù) 近端胃癌　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分FAT4抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用與機(jī)制研究研究背景和目的在全球范圍內(nèi),胃癌發(fā)病率位于男性的第四位,女性的第五位,但其死亡率與發(fā)病率第一位的肺癌相當(dāng)。2008年調(diào)查,在全球范圍內(nèi),胃癌的發(fā)病率占所有惡性腫瘤的8%,死亡率則達(dá)到了10%。在我國(guó),胃癌的發(fā)病率和死亡率均顯著高于西方國(guó)家,中國(guó)每年死于胃癌約有22.7萬人,占所有惡性腫瘤死亡的23%。侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征,也是其致死性的關(guān)鍵因素。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移涉及許多信號(hào)通路、分子的相互作用,是腫瘤研究關(guān)注的一個(gè)焦點(diǎn),目前對(duì)其研究都尚處于起步階段。胃癌的高致死率與其侵襲轉(zhuǎn)移的特性存在密切聯(lián)系,研究影響胃癌轉(zhuǎn)移侵襲的機(jī)制具有重要和現(xiàn)實(shí)的意義。脊椎動(dòng)物的FAT4基因是果蠅ft基因的同源基因。ft基因在果蠅整個(gè)發(fā)育過程中參與調(diào)控Hippo通路和平面細(xì)胞極性(PCP),是果蠅7個(gè)抑癌基因中的一個(gè)。雖然對(duì)于FAT4在脊椎動(dòng)物中是否也同樣參與Hippo通路的調(diào)控還存在爭(zhēng)議,但是目前已有的研究已經(jīng)提示FAT4與多種惡性腫瘤存在相關(guān)性。近幾年,基于全基因組的研究,對(duì)于FAT4與惡性腫瘤的相關(guān)性又有了新的發(fā)現(xiàn)。2011年一項(xiàng)對(duì)惡性膠質(zhì)瘤進(jìn)行全基因組測(cè)序的研究顯示21%的樣本存在FAT4的錯(cuò)義或無義突變。在胰腺癌、HCV相關(guān)肝細(xì)胞癌及頭頸部鱗癌中也報(bào)道了存在FAT4的錯(cuò)義或無義突變。據(jù)Yu-Hsuan Wu等最新研究報(bào)告,利用皰疹病毒上調(diào)miRNA31從而下調(diào)FAT4表達(dá)可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移,提示FAT4可能在癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移中具有重要的作用。同時(shí),Bossuyt W最新報(bào)道FAT4作為一個(gè)細(xì)胞粘附性蛋白影響細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)。這些研究提示FAT4可能作為癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制因子起作用。2012年5月?lián)㖞ang ZJ等報(bào)道,在復(fù)發(fā)性胃癌外顯子測(cè)序中發(fā)現(xiàn),FAT4可能是導(dǎo)致胃癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要的抑癌基因,并在細(xì)胞水平證實(shí)了FAT4低表達(dá)可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。由于國(guó)際上對(duì)于FAT4的研究較晚,目前的研究結(jié)果多局限于發(fā)現(xiàn)其與某種腫瘤的相關(guān)性。對(duì)于FAT4怎樣發(fā)揮其抑癌作用,怎樣負(fù)向調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移還沒有明確報(bào)道。YAP基因是Hippo信號(hào)通路下游的效應(yīng)分子,可被上游激酶磷酸化而被滯留在胞質(zhì)內(nèi),研究顯示在Hippo信號(hào)通路中,磷酸化的YAP可通過直接結(jié)合胞質(zhì)內(nèi)p-catenin而抑制其核移位,從而抑制wnt/β-catenin信號(hào)通路。已有報(bào)道稱YAP在胃癌中具有致癌作用。在以往經(jīng)典的研究中,已經(jīng)證明了Wnt通路在細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、細(xì)胞粘附和PCP過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。我們推測(cè)FAT4有可能通過wnt/β-catenin通路調(diào)控胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)方法免疫組化檢測(cè)160對(duì)胃癌及配對(duì)癌旁組織FAT4蛋白表達(dá)水平：根據(jù)FAT4著色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和著色強(qiáng)度水平,采用染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分的綜合方法進(jìn)行記分。分析FAT4蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。qRT-PCR分別檢測(cè)30對(duì)胃癌和配對(duì)癌旁組織FAT4 mRNA表達(dá)水平和不同胃癌細(xì)胞系FAT4表達(dá)水平。構(gòu)建FAT4干擾細(xì)胞株。采用MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FAT4對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲的影響。采用Western blot、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)等方法研究FAT4干擾對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響。采用Western blot、MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β-catenin對(duì)FAT4干擾誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲的影響。采用qRT-PCR、Western blot方法檢測(cè)EMT信號(hào)分子E-cadherin、γ-Catenin、N-cadherin和Vimentin水平來研究FAT4干擾對(duì)胃癌EMT的影響。通過裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn),裸鼠尾靜脈注射肝、肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FAT4干擾對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果FAT4在胃癌組織中表達(dá)下調(diào),160例胃癌組織中,38例胃癌組織標(biāo)本FAT4表達(dá)陽(yáng)性(23.8%),主要在細(xì)胞核、胞漿中表達(dá)。FAT4低表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.000)及存活率(P=0.017)顯著相關(guān)。FAT4低表達(dá)患者預(yù)后較差(P=0.014)。胃癌組織中FAT4 mRNA表達(dá)水平也顯著低于癌旁組織。與GES-1細(xì)胞相比,胃癌細(xì)胞株FAT4 mRNA表達(dá)水平下調(diào)。干擾FAT4可顯著增強(qiáng)BGC-823細(xì)胞和HGC-27細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力、侵襲能力和遷移能力。干擾FAT4可增加胃癌細(xì)胞核內(nèi)β-catenin水平,可顯著增強(qiáng)β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性以及可以激活BGC-823細(xì)胞和HGC-27細(xì)胞的Wnt/β-catenin i言號(hào)通路。干擾FAT4并不影響總蛋白中β-catenin含量,而是通過促進(jìn)β-catenin入核起到調(diào)節(jié)作用。干擾FAT4還可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。干擾β-catenin可抑制shlFAT4轉(zhuǎn)染的BGC-823細(xì)胞和HGC-27細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力、侵襲能力和遷移能力。干擾FAT4促進(jìn)BGC-823細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤能力,促進(jìn)裸鼠體內(nèi)腫瘤的肝、肺轉(zhuǎn)移。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn),與癌旁正常組織比較,FAT4在胃癌組織中呈低表達(dá),并且其低表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中,下調(diào)FAT4都表現(xiàn)出了可以通過β-catenin依賴的機(jī)制促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng),侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果提示,FAT4通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路起到腫瘤抑制物的作用,這為胃癌的治療提供了新的靶點(diǎn)。第二部分表達(dá)芯片加權(quán)共表達(dá)分析鑒定胃癌分子標(biāo)記研究背景和目的腫瘤標(biāo)志分子的研究一直都是腫瘤研究的熱點(diǎn)。表達(dá)芯片給我們提供了一個(gè)可以大規(guī)模篩查腫瘤的分子標(biāo)志物的手段。10余年來,人們積累了大量的基于表達(dá)芯片研究的數(shù)據(jù)。伴隨著芯片數(shù)據(jù)量的增加,產(chǎn)生了許多新的研究方法和手段來分析處理大量的芯片數(shù)據(jù)。比如薈萃分析和共表達(dá)分析等。通過這些生物信息學(xué)的方法我們可以同時(shí)對(duì)大量芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和深入的數(shù)據(jù)挖掘,找到疾病特異的差異基因和與臨床特征相關(guān)的基因。其中基因的共表達(dá)分析方法是研究不同基因之間的相關(guān)性的重要手段。在本研究中,為了尋找胃癌預(yù)后的分子標(biāo)志物,我們采用了加權(quán)基因共表達(dá)分析(WGCNA)的方法。WGCNA是一種在很多芯片中尋找基因共表達(dá)相互關(guān)系的系統(tǒng)生物學(xué)的方法。從它在2005年被首次提出以來,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在動(dòng)物學(xué)、植物性、微生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、腫瘤學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、炎癥和其他多種疾病的研究中。這種方法并不是研究成千上萬個(gè)基因與樣本特征的關(guān)系,而是關(guān)注一定數(shù)量的共表達(dá)的基因模塊與樣本某項(xiàng)特征的關(guān)系。使用WGCNA這一方法可以幫助我們發(fā)現(xiàn)潛在的生物學(xué)特征。實(shí)驗(yàn)方法所有芯片原始數(shù)據(jù)均從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)和Arrayexpress數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)下載。芯片數(shù)據(jù)集包括GSE13911, GSE29272, GSE35809, GSE15459, GSE38749。配對(duì)的胃癌和癌旁正常組織的芯片資料來自GSE13911, GSE29272。胃癌臨床特征數(shù)據(jù)的芯片來自GSE29272, GSE35809, GSE15459, GSE38749。含有胃癌預(yù)后資料的芯片來自GSE29272, GSE38749。所有數(shù)據(jù)集均采用Affymatrix公司人類全基因組芯片HG-U133A或HG-U133_Plus_2。采用R語言Bioconductor平臺(tái)下的強(qiáng)健多芯片平均(gcRMA)的方法進(jìn)行預(yù)處理。采用Bioconductor平臺(tái)下的"affy"包對(duì)芯片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。我們應(yīng)用“sva”包的ComBat功能,采用經(jīng)驗(yàn)貝葉斯方法調(diào)整批次效應(yīng)。采用Bioconductor平臺(tái)的"limma"包分析差異表達(dá)的基因。我們?cè)O(shè)定差異倍數(shù)(FC)1.5和p0.05作為差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)。我們采用R語言的"wgcna"軟件包進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。將得到的胃癌差異表達(dá)基因根據(jù)基因之間的相關(guān)性分為不同模塊。采用‘'wgcna"包得到模塊的特征基因,以及模塊內(nèi)所有基因與該模塊特征基因的相關(guān)性。采用"wgcna"包分析胃癌臨床特征與各個(gè)模塊和基因的相關(guān)性。用層次聚類的方法將所有基因分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,采用R語言‘'survival"包和對(duì)所有基因進(jìn)行COX生存分析,得到兩組的風(fēng)險(xiǎn)比(HR)基因的GO分析和KEGG通路分析采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。結(jié)果我們以FC1.5和p0.05為標(biāo)準(zhǔn),共篩選出1592個(gè)差異探針,對(duì)應(yīng)1161個(gè)差異基因。根據(jù)其在336個(gè)芯片中的表達(dá)水平,我們將1592個(gè)胃癌的差異表達(dá)探針進(jìn)行分類,構(gòu)建共表達(dá)模塊。我們首先選擇軟閡值,在p=4的情況下,無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)的擬合指數(shù)接近0.90。我們?nèi)缓蟛捎梅潜O(jiān)督的平均鏈接分層聚類的方法構(gòu)建了共表達(dá)模塊,按照模塊基因數(shù)20,模塊融合高度0.25為標(biāo)準(zhǔn),最后產(chǎn)生了11個(gè)模塊。紅色模塊與患者年齡負(fù)相關(guān),cor=-0.01,p=0.05；紅色色塊與性別正相關(guān),cor=0.18,p=8x10-4,紅色色塊內(nèi)基因在女性患者中高表達(dá)；棕色和黃色模塊與勞倫分型成正相關(guān),cor和p值分別為0.19,0.12和6×104和0.02；即棕色和黃色模塊的特征基因在非腸型胃癌中高表達(dá)。而紫色模塊與勞倫分型負(fù)相關(guān),其cor=-0.11,p=0.05,提示紫色模塊特征基因在腸型胃癌中高表達(dá)。黃色和紅色模塊特征基因和分化程度正相關(guān),cor和p值分別為0.16、0.11和0.003、0.05；說明腫瘤的分化越差,這些基因的表達(dá)值越高；而藍(lán)綠色、洋紅色和粉色模塊中,其特征基因在差分化的腫瘤中表達(dá)值下降,cor和p值分別為-0.12、-0.14、-0.13和0.003、0.01和0.02；洋紅色、黃綠色、黑色、棕色模塊與腫瘤的T分期負(fù)相關(guān),cor和p值分別為-0.14、-0.11、-0.13、-0.18和0.01、0.05、0.02、0.001；腫瘤的T分期越高、這些模塊特征基因的值約低。黃綠色、黑色和N分期正相關(guān),cor和p值分別為0.15、0.13和0.005、0.02；說明隨著N分期的增加,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)的增加,這兩個(gè)模塊特征基因的表達(dá)值逐漸增加。藍(lán)色、黃色模塊與N分期負(fù)相關(guān),cor和p值分別為-0.21、-0.12和8x10-、0.03；說明隨著N分期的增加,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)的增加,這兩個(gè)模塊特征基因的表達(dá)值逐漸降低。得到與某個(gè)臨床特征相關(guān)的模塊內(nèi)所有探針與該模塊特征基因的相關(guān)系數(shù)(MM)和與該臨床特征的相關(guān)系數(shù)(GS)。繪制了模塊內(nèi)的所有基因的MM值和GS值的繪制散點(diǎn)圖,得到核心基因。采用COX生存分析得到了160個(gè)與預(yù)后相關(guān)的探針(p0.05),對(duì)應(yīng)149個(gè)基因。結(jié)論表達(dá)芯片的WGCNA方法可以使我們同時(shí)獲得大量基因之間和基因與臨床特性的相關(guān)信息,并得到與各個(gè)臨床特征相關(guān)的核心基因。這些核心基因作為胃癌相關(guān)的分子標(biāo)志值得進(jìn)行深入的分子生物學(xué)研究。第三部分腹腔鏡與開腹近端胃癌D2根治手術(shù)的療效比較背景隨著腹腔鏡技術(shù)的快速發(fā)展,腹腔鏡輔助的胃切除術(shù)(LAG)已經(jīng)為廣大醫(yī)生和患者所接受。在全世界范圍內(nèi),LAG的手術(shù)量逐年增加。近年來,很多項(xiàng)臨床研究已經(jīng)證實(shí)了LAG在胃癌手術(shù)中的應(yīng)用價(jià)值,特別是在早期胃癌的治療方面,LAG已經(jīng)被寫入指南并加以推薦。但是對(duì)于進(jìn)展期胃癌患者是否適合采用腹腔鏡輔助的D2根治術(shù)仍存在爭(zhēng)議,進(jìn)展期的近端胃癌就是爭(zhēng)議的焦點(diǎn)之一。截止到目前,關(guān)于進(jìn)展期近端胃癌的腹腔鏡手術(shù)的相關(guān)研究少之又少,還不足以得到可靠的結(jié)論。所以我們進(jìn)行了這項(xiàng)回顧性的隊(duì)列研究,來比較腹腔鏡輔助的保留胰脾的D2根治手術(shù)和傳統(tǒng)的開放式保留胰脾的D2根治術(shù)對(duì)于進(jìn)展期胃癌患者近遠(yuǎn)期療效的影響。方法我們回顧了2008年3月到2012年3月間在我院行保留胰脾的D2根治術(shù)的進(jìn)展期胃癌患者。其中腹腔鏡手術(shù)組41例,開腹手術(shù)組43例。我們對(duì)這兩組患者的近遠(yuǎn)期療效進(jìn)行了比較。結(jié)果兩組中包括性別,BMI,年齡,并存疾病,ECOG評(píng)分等臨床特征的基線資料比較沒有顯著差異。開腹手術(shù)的平均手術(shù)時(shí)間較腹腔鏡手術(shù)組明顯縮短,(188.72±44.429min OG組vs.269.15±49.167 min LAG組,p=0.001)。開腹手術(shù)組的估計(jì)失血量較腹腔鏡手術(shù)組明顯增加(303.26±163.616 ml OG組vs.219.51±125.438ml LAG組,p=0.010)。開腹手術(shù)組術(shù)后體溫大于37℃的天數(shù)較腹腔鏡手術(shù)組顯著增加(6.0000±3.38062天OG組vs.3.3902±1.51456天LAG組,p=0.001)。兩組術(shù)后并發(fā)癥,清掃淋巴結(jié)數(shù)目,兩組術(shù)后腫瘤浸潤(rùn)深度,TNM分期,組織學(xué)分級(jí)等病理結(jié)果比較均沒有顯著差異(p0.05)兩組都沒有發(fā)生圍手術(shù)期的死亡,開腹組和腹腔鏡組術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率分別為23.26%和14.63%,兩組比較沒有顯著差異(p=0.314)。開腹手術(shù)組平均生存期38.664月,95%可信區(qū)間為33.252-44.075月；腹腔鏡手術(shù)組平均生存期35.768月,95%可信區(qū)間為30.621-40.916月。兩組總生存率差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)p=0.710)。結(jié)論對(duì)于適合行保留胰脾的D2胃癌根治術(shù)的進(jìn)展期胃癌患者,腹腔鏡手術(shù)是一種安全有效的方式,其根治性、治愈率和生存率均與開腹手術(shù)相當(dāng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 吳建林;劉衛(wèi)仁;于穎彥;計(jì)駿;張佳年;陳雪華;劉炳亞;朱正綱;;胃癌4q28位點(diǎn)雜合性缺失的研究與候選基因FAT4表達(dá)的驗(yàn)證[J];診斷學(xué)理論與實(shí)踐;2009年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 蔡建;FAT4抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用與機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：1547743