本文關鍵詞： FAT4 胃癌 腫瘤轉移 Wnt/β-catenin 上皮間質轉化 胃癌 表達芯片 加權基因共表達分析 生存分析 進展期胃癌 D2淋巴結清掃 腹腔鏡輔助胃切除術 近端胃癌　出處：《第二軍醫(yī)大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分FAT4抑制胃癌侵襲轉移的作用與機制研究研究背景和目的在全球范圍內(nèi),胃癌發(fā)病率位于男性的第四位,女性的第五位,但其死亡率與發(fā)病率第一位的肺癌相當。2008年調查,在全球范圍內(nèi),胃癌的發(fā)病率占所有惡性腫瘤的8%,死亡率則達到了10%。在我國,胃癌的發(fā)病率和死亡率均顯著高于西方國家,中國每年死于胃癌約有22.7萬人,占所有惡性腫瘤死亡的23%。侵襲轉移是惡性腫瘤的重要特征,也是其致死性的關鍵因素。腫瘤的侵襲轉移涉及許多信號通路、分子的相互作用,是腫瘤研究關注的一個焦點,目前對其研究都尚處于起步階段。胃癌的高致死率與其侵襲轉移的特性存在密切聯(lián)系,研究影響胃癌轉移侵襲的機制具有重要和現(xiàn)實的意義。脊椎動物的FAT4基因是果蠅ft基因的同源基因。ft基因在果蠅整個發(fā)育過程中參與調控Hippo通路和平面細胞極性(PCP),是果蠅7個抑癌基因中的一個。雖然對于FAT4在脊椎動物中是否也同樣參與Hippo通路的調控還存在爭議,但是目前已有的研究已經(jīng)提示FAT4與多種惡性腫瘤存在相關性。近幾年,基于全基因組的研究,對于FAT4與惡性腫瘤的相關性又有了新的發(fā)現(xiàn)。2011年一項對惡性膠質瘤進行全基因組測序的研究顯示21%的樣本存在FAT4的錯義或無義突變。在胰腺癌、HCV相關肝細胞癌及頭頸部鱗癌中也報道了存在FAT4的錯義或無義突變。據(jù)Yu-Hsuan Wu等最新研究報告,利用皰疹病毒上調miRNA31從而下調FAT4表達可以促進內(nèi)皮細胞的運動和轉移,提示FAT4可能在癌細胞的遷移和轉移中具有重要的作用。同時,Bossuyt W最新報道FAT4作為一個細胞粘附性蛋白影響細胞的遷移運動。這些研究提示FAT4可能作為癌細胞侵襲轉移的抑制因子起作用。2012年5月?lián)㖞ang ZJ等報道,在復發(fā)性胃癌外顯子測序中發(fā)現(xiàn),FAT4可能是導致胃癌復發(fā)和轉移的一個重要的抑癌基因,并在細胞水平證實了FAT4低表達可以促進胃癌細胞的侵襲、轉移。由于國際上對于FAT4的研究較晚,目前的研究結果多局限于發(fā)現(xiàn)其與某種腫瘤的相關性。對于FAT4怎樣發(fā)揮其抑癌作用,怎樣負向調節(jié)胃癌細胞的侵襲、轉移還沒有明確報道。YAP基因是Hippo信號通路下游的效應分子,可被上游激酶磷酸化而被滯留在胞質內(nèi),研究顯示在Hippo信號通路中,磷酸化的YAP可通過直接結合胞質內(nèi)p-catenin而抑制其核移位,從而抑制wnt/β-catenin信號通路。已有報道稱YAP在胃癌中具有致癌作用。在以往經(jīng)典的研究中,已經(jīng)證明了Wnt通路在細胞的侵襲轉移、細胞粘附和PCP過程中起到重要的調節(jié)作用。我們推測FAT4有可能通過wnt/β-catenin通路調控胃癌的侵襲轉移。實驗方法免疫組化檢測160對胃癌及配對癌旁組織FAT4蛋白表達水平：根據(jù)FAT4著色的陽性細胞數(shù)和著色強度水平,采用染色強度評分和陽性細胞數(shù)評分的綜合方法進行記分。分析FAT4蛋白表達與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關系,采用Kaplan-Meier法進行生存分析。qRT-PCR分別檢測30對胃癌和配對癌旁組織FAT4 mRNA表達水平和不同胃癌細胞系FAT4表達水平。構建FAT4干擾細胞株。采用MTT、克隆形成實驗、Transwell侵襲實驗、Transwell遷移實驗檢測FAT4對細胞生長及侵襲的影響。采用Western blot、雙熒光素酶報告基因檢測等方法研究FAT4干擾對Wnt/β-catenin信號通路的影響。采用Western blot、MTT、克隆形成實驗、Transwell侵襲實驗、Transwell遷移實驗檢測β-catenin對FAT4干擾誘導的胃癌細胞生長及侵襲的影響。采用qRT-PCR、Western blot方法檢測EMT信號分子E-cadherin、γ-Catenin、N-cadherin和Vimentin水平來研究FAT4干擾對胃癌EMT的影響。通過裸鼠皮下成瘤實驗,裸鼠尾靜脈注射肝、肺轉移實驗檢測FAT4干擾對體內(nèi)腫瘤生長及轉移的影響。結果FAT4在胃癌組織中表達下調,160例胃癌組織中,38例胃癌組織標本FAT4表達陽性(23.8%),主要在細胞核、胞漿中表達。FAT4低表達與患者淋巴結轉移(P=0.000)及存活率(P=0.017)顯著相關。FAT4低表達患者預后較差(P=0.014)。胃癌組織中FAT4 mRNA表達水平也顯著低于癌旁組織。與GES-1細胞相比,胃癌細胞株FAT4 mRNA表達水平下調。干擾FAT4可顯著增強BGC-823細胞和HGC-27細胞增殖能力、克隆形成能力、侵襲能力和遷移能力。干擾FAT4可增加胃癌細胞核內(nèi)β-catenin水平,可顯著增強β-catenin/TCF轉錄活性以及可以激活BGC-823細胞和HGC-27細胞的Wnt/β-catenin i言號通路。干擾FAT4并不影響總蛋白中β-catenin含量,而是通過促進β-catenin入核起到調節(jié)作用。干擾FAT4還可以誘導胃癌細胞上皮間質轉化。干擾β-catenin可抑制shlFAT4轉染的BGC-823細胞和HGC-27細胞的增殖能力、克隆形成能力、侵襲能力和遷移能力。干擾FAT4促進BGC-823細胞的裸鼠皮下成瘤能力,促進裸鼠體內(nèi)腫瘤的肝、肺轉移。結論本研究發(fā)現(xiàn),與癌旁正常組織比較,FAT4在胃癌組織中呈低表達,并且其低表達和淋巴結轉移及不良預后密切相關。在體內(nèi)、體外實驗中,下調FAT4都表現(xiàn)出了可以通過β-catenin依賴的機制促進腫瘤的生長,侵襲和轉移。本研究結果提示,FAT4通過調控Wnt/β-catenin信號通路起到腫瘤抑制物的作用,這為胃癌的治療提供了新的靶點。第二部分表達芯片加權共表達分析鑒定胃癌分子標記研究背景和目的腫瘤標志分子的研究一直都是腫瘤研究的熱點。表達芯片給我們提供了一個可以大規(guī)模篩查腫瘤的分子標志物的手段。10余年來,人們積累了大量的基于表達芯片研究的數(shù)據(jù)。伴隨著芯片數(shù)據(jù)量的增加,產(chǎn)生了許多新的研究方法和手段來分析處理大量的芯片數(shù)據(jù)。比如薈萃分析和共表達分析等。通過這些生物信息學的方法我們可以同時對大量芯片數(shù)據(jù)進行分析和深入的數(shù)據(jù)挖掘,找到疾病特異的差異基因和與臨床特征相關的基因。其中基因的共表達分析方法是研究不同基因之間的相關性的重要手段。在本研究中,為了尋找胃癌預后的分子標志物,我們采用了加權基因共表達分析(WGCNA)的方法。WGCNA是一種在很多芯片中尋找基因共表達相互關系的系統(tǒng)生物學的方法。從它在2005年被首次提出以來,已經(jīng)被廣泛應用在動物學、植物性、微生物學、神經(jīng)科學、腫瘤學、發(fā)育生物學、炎癥和其他多種疾病的研究中。這種方法并不是研究成千上萬個基因與樣本特征的關系,而是關注一定數(shù)量的共表達的基因模塊與樣本某項特征的關系。使用WGCNA這一方法可以幫助我們發(fā)現(xiàn)潛在的生物學特征。實驗方法所有芯片原始數(shù)據(jù)均從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)和Arrayexpress數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)下載。芯片數(shù)據(jù)集包括GSE13911, GSE29272, GSE35809, GSE15459, GSE38749。配對的胃癌和癌旁正常組織的芯片資料來自GSE13911, GSE29272。胃癌臨床特征數(shù)據(jù)的芯片來自GSE29272, GSE35809, GSE15459, GSE38749。含有胃癌預后資料的芯片來自GSE29272, GSE38749。所有數(shù)據(jù)集均采用Affymatrix公司人類全基因組芯片HG-U133A或HG-U133_Plus_2。采用R語言Bioconductor平臺下的強健多芯片平均(gcRMA)的方法進行預處理。采用Bioconductor平臺下的"affy"包對芯片進行標準化。我們應用“sva”包的ComBat功能,采用經(jīng)驗貝葉斯方法調整批次效應。采用Bioconductor平臺的"limma"包分析差異表達的基因。我們設定差異倍數(shù)(FC)1.5和p0.05作為差異基因的篩選標準。我們采用R語言的"wgcna"軟件包進行加權基因共表達網(wǎng)絡的構建。將得到的胃癌差異表達基因根據(jù)基因之間的相關性分為不同模塊。采用‘'wgcna"包得到模塊的特征基因,以及模塊內(nèi)所有基因與該模塊特征基因的相關性。采用"wgcna"包分析胃癌臨床特征與各個模塊和基因的相關性。用層次聚類的方法將所有基因分為高表達組和低表達組,采用R語言‘'survival"包和對所有基因進行COX生存分析,得到兩組的風險比(HR)基因的GO分析和KEGG通路分析采用DAVID數(shù)據(jù)庫進行分析。結果我們以FC1.5和p0.05為標準,共篩選出1592個差異探針,對應1161個差異基因。根據(jù)其在336個芯片中的表達水平,我們將1592個胃癌的差異表達探針進行分類,構建共表達模塊。我們首先選擇軟閡值,在p=4的情況下,無標度網(wǎng)絡的擬合指數(shù)接近0.90。我們?nèi)缓蟛捎梅潜O(jiān)督的平均鏈接分層聚類的方法構建了共表達模塊,按照模塊基因數(shù)20,模塊融合高度0.25為標準,最后產(chǎn)生了11個模塊。紅色模塊與患者年齡負相關,cor=-0.01,p=0.05；紅色色塊與性別正相關,cor=0.18,p=8x10-4,紅色色塊內(nèi)基因在女性患者中高表達；棕色和黃色模塊與勞倫分型成正相關,cor和p值分別為0.19,0.12和6×104和0.02；即棕色和黃色模塊的特征基因在非腸型胃癌中高表達。而紫色模塊與勞倫分型負相關,其cor=-0.11,p=0.05,提示紫色模塊特征基因在腸型胃癌中高表達。黃色和紅色模塊特征基因和分化程度正相關,cor和p值分別為0.16、0.11和0.003、0.05；說明腫瘤的分化越差,這些基因的表達值越高；而藍綠色、洋紅色和粉色模塊中,其特征基因在差分化的腫瘤中表達值下降,cor和p值分別為-0.12、-0.14、-0.13和0.003、0.01和0.02；洋紅色、黃綠色、黑色、棕色模塊與腫瘤的T分期負相關,cor和p值分別為-0.14、-0.11、-0.13、-0.18和0.01、0.05、0.02、0.001；腫瘤的T分期越高、這些模塊特征基因的值約低。黃綠色、黑色和N分期正相關,cor和p值分別為0.15、0.13和0.005、0.02；說明隨著N分期的增加,淋巴結轉移數(shù)的增加,這兩個模塊特征基因的表達值逐漸增加。藍色、黃色模塊與N分期負相關,cor和p值分別為-0.21、-0.12和8x10-、0.03；說明隨著N分期的增加,淋巴結轉移數(shù)的增加,這兩個模塊特征基因的表達值逐漸降低。得到與某個臨床特征相關的模塊內(nèi)所有探針與該模塊特征基因的相關系數(shù)(MM)和與該臨床特征的相關系數(shù)(GS)。繪制了模塊內(nèi)的所有基因的MM值和GS值的繪制散點圖,得到核心基因。采用COX生存分析得到了160個與預后相關的探針(p0.05),對應149個基因。結論表達芯片的WGCNA方法可以使我們同時獲得大量基因之間和基因與臨床特性的相關信息,并得到與各個臨床特征相關的核心基因。這些核心基因作為胃癌相關的分子標志值得進行深入的分子生物學研究。第三部分腹腔鏡與開腹近端胃癌D2根治手術的療效比較背景隨著腹腔鏡技術的快速發(fā)展,腹腔鏡輔助的胃切除術(LAG)已經(jīng)為廣大醫(yī)生和患者所接受。在全世界范圍內(nèi),LAG的手術量逐年增加。近年來,很多項臨床研究已經(jīng)證實了LAG在胃癌手術中的應用價值,特別是在早期胃癌的治療方面,LAG已經(jīng)被寫入指南并加以推薦。但是對于進展期胃癌患者是否適合采用腹腔鏡輔助的D2根治術仍存在爭議,進展期的近端胃癌就是爭議的焦點之一。截止到目前,關于進展期近端胃癌的腹腔鏡手術的相關研究少之又少,還不足以得到可靠的結論。所以我們進行了這項回顧性的隊列研究,來比較腹腔鏡輔助的保留胰脾的D2根治手術和傳統(tǒng)的開放式保留胰脾的D2根治術對于進展期胃癌患者近遠期療效的影響。方法我們回顧了2008年3月到2012年3月間在我院行保留胰脾的D2根治術的進展期胃癌患者。其中腹腔鏡手術組41例,開腹手術組43例。我們對這兩組患者的近遠期療效進行了比較。結果兩組中包括性別,BMI,年齡,并存疾病,ECOG評分等臨床特征的基線資料比較沒有顯著差異。開腹手術的平均手術時間較腹腔鏡手術組明顯縮短,(188.72±44.429min OG組vs.269.15±49.167 min LAG組,p=0.001)。開腹手術組的估計失血量較腹腔鏡手術組明顯增加(303.26±163.616 ml OG組vs.219.51±125.438ml LAG組,p=0.010)。開腹手術組術后體溫大于37℃的天數(shù)較腹腔鏡手術組顯著增加(6.0000±3.38062天OG組vs.3.3902±1.51456天LAG組,p=0.001)。兩組術后并發(fā)癥,清掃淋巴結數(shù)目,兩組術后腫瘤浸潤深度,TNM分期,組織學分級等病理結果比較均沒有顯著差異(p0.05)兩組都沒有發(fā)生圍手術期的死亡,開腹組和腹腔鏡組術后并發(fā)癥的發(fā)生率分別為23.26%和14.63%,兩組比較沒有顯著差異(p=0.314)。開腹手術組平均生存期38.664月,95%可信區(qū)間為33.252-44.075月；腹腔鏡手術組平均生存期35.768月,95%可信區(qū)間為30.621-40.916月。兩組總生存率差異沒有統(tǒng)計學意義(對數(shù)秩檢驗p=0.710)。結論對于適合行保留胰脾的D2胃癌根治術的進展期胃癌患者,腹腔鏡手術是一種安全有效的方式,其根治性、治愈率和生存率均與開腹手術相當。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2

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本文編號：1547743