本文關(guān)鍵詞： 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 活性氧族 細(xì)胞凋亡 硫辛酸 蘋(píng)果酸酶-1 抗體表征　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：單克隆抗體(monoclonal antibody,m Ab)藥物因具有靶向性高、副作用小、療效持久等優(yōu)點(diǎn),目前已成為腫瘤治療的重要手段之一。截至2016年2月全球已有21個(gè)抗腫瘤單克隆抗體藥物獲批上市,用于多種實(shí)體瘤、血液腫瘤等的治療。如何進(jìn)一步提高抗體藥物的產(chǎn)量,以滿(mǎn)足日益擴(kuò)大的市場(chǎng)需求已成為亟待解決的技術(shù)難題。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary,CHO)是目前抗體藥物產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用最廣泛、培養(yǎng)工藝最成熟的真核宿主表達(dá)細(xì)胞。在CHO細(xì)胞工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡是在培養(yǎng)中后期導(dǎo)致活細(xì)胞密度下降,進(jìn)而影響單抗藥物表達(dá)量的主要因素之一。細(xì)胞有氧代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧族(reactive oxygen species,ROS)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),本課題旨在探究ROS在CHO細(xì)胞補(bǔ)料批次培養(yǎng)中的作用、機(jī)制和調(diào)控方式,從而有效提高單克隆抗體藥物的表達(dá)量。本課題利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)批次培養(yǎng)中CHO細(xì)胞內(nèi)ROS水平,結(jié)果顯示隨著細(xì)胞密度的增長(zhǎng),ROS水平迅速升高;當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到最高密度后細(xì)胞活率、活細(xì)胞密度均發(fā)生驟降。在CHO細(xì)胞批次培養(yǎng)中分別加入50、100、200μM過(guò)氧化氫(H2O2),發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞均受到不同程度的生長(zhǎng)抑制。這提示細(xì)胞內(nèi)ROS積累與生長(zhǎng)衰退有一定關(guān)系。本課題從兩個(gè)方面對(duì)CHO細(xì)胞培養(yǎng)中ROS水平進(jìn)行調(diào)控。首先是外源途徑,即在培養(yǎng)基中額外添加還原性物質(zhì)硫辛酸。在批次培養(yǎng)中分別向培養(yǎng)基中添加0、25、50、100與200μM硫辛酸,結(jié)果顯示100μM組活細(xì)胞密度積分(IVCD)最高,為54.65×106 cells/m L days,因此將補(bǔ)料批次培養(yǎng)中硫辛酸的添加濃度設(shè)為100μM。應(yīng)用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)對(duì)照組與硫辛酸組細(xì)胞內(nèi)ROS水平,結(jié)果顯示在培養(yǎng)第五至八天硫辛酸組細(xì)胞的ROS水平均顯著低于對(duì)照組;使用臺(tái)盼藍(lán)拒染法描記CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、活率圖,結(jié)果顯示在培養(yǎng)中后期,與對(duì)照組相比100μM硫辛酸組的活細(xì)胞密度、細(xì)胞活率、IVCD均顯著增高;同時(shí)利用高效液相色譜法檢測(cè)培養(yǎng)終末期對(duì)照組細(xì)胞上清抗體濃度為0.88 g/L,硫辛酸組濃度為1.04 g/L,表達(dá)量提高約18.0%,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);在抗體表征方面,還原與非還原性SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,硫辛酸組細(xì)胞表達(dá)的單克隆抗體分子在二硫鍵修飾上與對(duì)照組一致;通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)抗體N-糖基化修飾,結(jié)果表明兩組的主要糖型種類(lèi)及所占比例無(wú)顯著差異;同時(shí)我們通過(guò)Annexin V/PI法檢測(cè)兩組細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示在補(bǔ)料批次培養(yǎng)第八至十天硫辛酸組細(xì)胞凋亡率均顯著低于對(duì)照組細(xì)胞,且western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí),培養(yǎng)后期對(duì)照組凋亡發(fā)生相關(guān)蛋白Caspase-7剪切體表達(dá)水平高于硫辛酸組細(xì)胞。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,硫辛酸顯著降低了CHO胞內(nèi)ROS水平,抑制補(bǔ)料批次培養(yǎng)中后期細(xì)胞凋亡,提高了活細(xì)胞密度積分及單克隆抗體表達(dá)量。第二方面是通過(guò)內(nèi)源途徑對(duì)ROS水平進(jìn)行調(diào)控。蘋(píng)果酸酶-1(malic enzyme 1,ME-1)主要作用是催化胞漿內(nèi)蘋(píng)果酸氧化脫羧,此過(guò)程同時(shí)伴隨NADP+的還原反應(yīng)。本課題利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了pc DNA3.0-ME-1真核表達(dá)載體,細(xì)胞轉(zhuǎn)染后通過(guò)抗生素篩選得到穩(wěn)定表達(dá)ME-1基因的CHO細(xì)胞庫(kù)(CHO-ME-1 pool)。在CHO-ME-1細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞的補(bǔ)料批次培養(yǎng)中,檢測(cè)顯示在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CHO-ME-1組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著低于對(duì)照組。細(xì)胞生長(zhǎng)活率方面,從培養(yǎng)第八天直至培養(yǎng)終末期,CHO-ME-1組的活細(xì)胞密度、細(xì)胞活率均高于對(duì)照組,IVCD值提高了約33.0%,抗體表達(dá)量提高了約16.9%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)�？贵w藥物表征研究結(jié)果顯示,CHO-ME-1細(xì)胞表達(dá)的抗體在分子量、二硫鍵修飾、N-糖基化修飾等方面與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異,符合預(yù)期質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)中后期,CHO-ME-1組細(xì)胞凋亡率、Caspase-7活化剪切體的表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組(p0.01)。本課題發(fā)現(xiàn),ROS的過(guò)量累積會(huì)對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用,通過(guò)建立內(nèi)源、外源兩種途徑可以有效降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平,優(yōu)化CHO細(xì)胞在補(bǔ)料批次培養(yǎng)中的生長(zhǎng)、提高IVCD與抗體表達(dá)量,并且對(duì)單克隆抗體藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性未產(chǎn)生顯著影響。該方法的建立將對(duì)CHO細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)化、培養(yǎng)工藝的開(kāi)發(fā)及新型高表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建、篩選等工作具有重要指導(dǎo)作用,也為我國(guó)抗體藥物產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展提供技術(shù)支持。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R73-36

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 彭岳;趙鐵建;謝海源;韋燕飛;;細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中一些細(xì)節(jié)問(wèn)題的探討[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2009年06期

2 鄭麗君;夏文美;童村;;HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)與使用[J];醫(yī)藥工業(yè);1983年10期

3 李少英;李月秋;朱金玲;;三種細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的觀察[J];佳木斯醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1995年06期

4 嚴(yán)國(guó)俊;裴燕芳;朱貞宏;吳潔穎;潘金火;;實(shí)時(shí)細(xì)胞電子分析技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展[J];中國(guó)藥學(xué)雜志;2014年03期

5 陳必良,穆潤(rùn)華,馬向東,王德堂,辛?xí)匝?鄭維國(guó),嚴(yán)瑞蘭;特異性反義寡核苷酸對(duì)含HPV16的SiHa細(xì)胞的作用[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年03期

6 孟洪弟,戚豫,潘虹,吳希如;無(wú)線粒體DNA的ρ°206細(xì)胞的培養(yǎng)及其呼吸鏈功能損害[J];中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志;2000年03期

7 何秉燕;鄧長(zhǎng)生;鄒典定;劉湘芬;易有榮;;G-CSF對(duì)洛伐他汀誘導(dǎo)的K562細(xì)胞內(nèi)酸堿度及凋亡的影響[J];中華血液學(xué)雜志;2006年07期

8 黃靜紅;李德如;閻國(guó)富;;蘿卜硫素對(duì)HaCaT細(xì)胞的影響研究[J];中國(guó)美容醫(yī)學(xué);2010年11期

9 章靜波,葉祝三;保護(hù)正常組織和細(xì)胞——腫瘤化療研究中的一個(gè)動(dòng)向[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)參考資料(腫瘤學(xué)分冊(cè));1978年01期

10 章靜波;薛新華;;細(xì)胞松弛菌素D對(duì)EC_a-109細(xì)胞的作用[J];解剖學(xué)報(bào);1979年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 劉令九;趙小琳;岳立廣;徐艷玲;李淑焱;侯麗娟;隋紅;姜崴;謝寶生;李勇;劉兵;李海濱;;細(xì)胞工廠培養(yǎng)人胚肺二倍體細(xì)胞制備凍干甲型肝炎減毒活疫苗[A];2011中國(guó)生物制品年會(huì)暨第十一次全國(guó)生物制品學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

2 宋征;;應(yīng)用Bhas42細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)22個(gè)腫瘤促長(zhǎng)基因標(biāo)志物[A];2013年（第三屆）中國(guó)藥物毒理學(xué)年會(huì)暨藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)研究論壇論文摘要[C];2013年

3 谷彬;張輝;喻澤蘭;;依地福新對(duì)Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)抑制機(jī)制的研究[A];2009醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十一屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

4 武冬梅;李秀娥;葛莉亞;袁星;;雙酚-A對(duì)MCF-7細(xì)胞伏安行為的影響[A];第五屆全國(guó)環(huán)境化學(xué)大會(huì)摘要集[C];2009年

5 李曉飛;呂超;吳小榮;韓慶玲;王杰;易宗春;;鉛和鋁離子對(duì)K562細(xì)胞紅系分化的影響[A];全國(guó)生化/工業(yè)與衛(wèi)生毒理學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2010年

6 宋為民;郭波;;復(fù)方甘草酸苷對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)AQP3的影響[A];2011全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

7 劉魯明;錢(qián)華;陳震;林勝友;黃挺;;參麥注射液對(duì)腫瘤細(xì)胞環(huán)核甘酸的影響[A];全國(guó)中醫(yī)藥科研與教學(xué)改革研討會(huì)論文集[C];2000年

8 張雪玲;糜漫天;李等松;韋娜;張乾勇;楊志祥;;Lovastatin對(duì)HL-60細(xì)胞HMG-CoA還原酶mRNA表達(dá)及細(xì)胞增殖功能的影響[A];中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)特殊營(yíng)養(yǎng)第五屆學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2002年

9 房佰俊;廖聯(lián)明;楊少光;史明霞;趙春華;;胎兒骨髓源原始干細(xì)胞分離純化及其生物學(xué)特性的初步研究[A];第九屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要匯編[C];2003年

10 李曉軍;朱傳東;汪萍;賈麗;陳芳芳;夏欣一;陳龍邦;;人Id3基因在A549細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)功能的研究[A];第六屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2008年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 記者 吳春燕 通訊員 寧習(xí)源 吳劍鵬;人類(lèi)情緒可影響干細(xì)胞生長(zhǎng)[N];光明日?qǐng)?bào);2014年

2 馮衛(wèi)東;老化干細(xì)胞可轉(zhuǎn)變成年輕干細(xì)胞[N];科技日?qǐng)?bào);2012年

3 常麗君;科學(xué)家闡明核內(nèi)周期運(yùn)作機(jī)制[N];科技日?qǐng)?bào);2011年

4 本版編輯邋杜華斌 邰舉 毛文波 顧鋼 陳超 何屹 毛黎;2007年世界科技發(fā)展回顧(六)[N];科技日?qǐng)?bào);2008年

5 通訊員 李靜;廈大教授發(fā)現(xiàn)細(xì)胞防癌“玄機(jī)”[N];廈門(mén)日?qǐng)?bào);2009年

6 永誠(chéng);美發(fā)現(xiàn)控制細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2000年

7 記者 張孟軍;加找到刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)分子[N];科技日?qǐng)?bào);2001年

8 張?zhí)锟?干細(xì)胞研究精彩紛呈[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2011年

9 邵薇/編譯;T細(xì)胞的非凡能力[N];北京科技報(bào);2003年

10 經(jīng)天;控制細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)[N];中藥事業(yè)報(bào);2000年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 蔣淵;缺氧肝癌細(xì)胞中HIF-1和NF-κB的相互作用及其分子機(jī)制的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 張廣;肝星狀細(xì)胞在肝癌細(xì)胞惡性行為中的作用及機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2015年

3 付托;活性氧族在CHO細(xì)胞補(bǔ)料批次培養(yǎng)中的作用、機(jī)制及調(diào)控研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

4 楊小超;陽(yáng)離子配體修飾的納米金用于細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和微囊自組裝研究[D];重慶大學(xué);2010年

5 葉玲玲;基于生物素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的HEK293細(xì)胞多基因代謝工程改造[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

6 梁國(guó)斌;產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)谷胱甘肽過(guò)程控制與優(yōu)化[D];江南大學(xué);2008年

7 楊海虹;鈣池操縱性鈣內(nèi)流在人肺腺癌A549細(xì)胞中的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

8 常玉娟;基于Nrf2/ARE通路辛開(kāi)苦降方胃康寧對(duì)人胃粘膜上皮細(xì)胞SOD2、GSTP1相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2015年

9 楊麗君;人Fcα/μR的表達(dá)與功能的初步研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

10 李曼;DRC3f及eRF3b在肝病發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制的初步研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 柯自立;硫酸鎂對(duì)6-羥基多巴胺損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

2 李婷婷;細(xì)胞穿透肽VP22對(duì)抑癌蛋白PTEN體外抗腫瘤作用影響的研究[D];川北醫(yī)學(xué)院;2015年

3 王靜;環(huán)氧化物酶抑制劑NS-398聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和凋亡的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 鄭祿祿;番茄紅素對(duì)轉(zhuǎn)染SOD1-G93A的PC12細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

5 宋晨源;氯化銨對(duì)人正常肝細(xì)胞系changliver中二氫乳清酸脫氫酶表達(dá)的影響[D];鄭州大學(xué);2015年

6 張莉;白藜蘆醇體外抑制腸道病毒71型的作用機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2015年

7 高華武;富硒芪云抗腫瘤作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];安徽中醫(yī)藥大學(xué);2015年

8 宋加奎;丹參對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞化療敏感性的影響[D];安徽中醫(yī)藥大學(xué);2015年

9 許雅鑫;尼古丁對(duì)NCI-H1975和NCI-H460細(xì)胞促進(jìn)增殖作用及對(duì)PI3K/Akt通路的影響研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

10 高娜;加減駐景方含藥血清對(duì)二氯化鈷誘導(dǎo)后ARPE-19細(xì)胞表達(dá)VEGF及HIF-1α的影響[D];青海大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：1536036