本文關(guān)鍵詞： 結(jié)直腸癌 基因突變 輔助化療 新一代測(cè)序技術(shù) 分子標(biāo)志物　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：本論文以我國(guó)常見的惡性腫瘤之一結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)為研究對(duì)象,從腫瘤基因突變檢測(cè),結(jié)腸癌輔助化療預(yù)后相關(guān)基因分子標(biāo)志評(píng)估,基于高通量測(cè)序的新型生物分子標(biāo)志篩選幾個(gè)領(lǐng)域進(jìn)行探索性研究,內(nèi)容主要包括兩個(gè)部分：第一部分 結(jié)直腸癌靶向治療相關(guān)分子靶點(diǎn)檢測(cè)及臨床意義研究隨著精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代的到來(lái),基于基因分子分型從而指導(dǎo)臨床實(shí)踐的個(gè)體化治療已經(jīng)廣泛開展。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因下游信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因如PIK3CA、NRAS、KRAS和BRAF基因在CRC的發(fā)生發(fā)展中都起到重要作用,大量研究表明KRAS和NRAS基因野生型患者才能從靶向治療中獲益,而PIK3CA和BRAF基因突變狀態(tài)也會(huì)影響患者的治療效果和預(yù)后。在接受根治性手術(shù)切除的早期結(jié)腸癌中,術(shù)后輔助化療能給患者帶來(lái)生存獲益,然而能夠預(yù)測(cè)療效和評(píng)價(jià)預(yù)后的基因分子標(biāo)志較少且有較大爭(zhēng)議,因此對(duì)相關(guān)基因的突變檢測(cè)和預(yù)后關(guān)聯(lián)研究對(duì)于指導(dǎo)臨床實(shí)踐有重要意義。本部分具體研究?jī)?nèi)容如下：第一、中國(guó)結(jié)直腸癌患者PIK3CA和NRAS基因突變頻譜研究。我們利用直接測(cè)序法在676例中國(guó)CRC患者中檢測(cè)磷酸肌醇3激酶(phosphotylinosital 3 kinase, PIK3CA)基因第9和20外顯子熱點(diǎn)區(qū)域和神經(jīng)母細(xì)胞瘤RAS病毒癌基因同源物(neuroblastoma RAS viral oncogene homolog, NRAS)基因第12,13和61號(hào)密碼子突變狀態(tài),以明確相關(guān)基因突變?cè)谥袊?guó)CRC患者中的分布情況,并結(jié)合臨床特征進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明PIK3CA基因突變率為9.9%(62/625),其中第9外顯子突變率為7.0%(45/643),第20外顯子突變率為2.7%(17/636)：NRAS基因突變率為4.2%(26/621),其中第12、13和61密碼子突變率分別為1.27%(8/630)、0.48%(3/630)和2.02%(13/643)。結(jié)合臨床資料分析顯示PIK3CA基因突變率在結(jié)腸腫瘤中高于直腸腫瘤(15.1% vs 6.1%,P0.001),而NRAS基因突變?cè)谀[瘤不同分期中突變率不同(P=0.03),且NRAS基因在腫瘤轉(zhuǎn)移中突變率更高(12.2% vs 3.3%,P=0.01)。第二、結(jié)腸癌基因突變檢測(cè)及輔助化療相關(guān)研究。本研究中我們共收集了124例Ⅱ期結(jié)腸癌和104例Ⅲ期結(jié)腸癌患者腫瘤組織樣本,利用直接測(cè)序法檢測(cè)鼠Kirsten肉瘤病毒致癌基因同源物(v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, KRAS)基因第12、13和61密碼子、鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B1 (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1, BRAF)基因第11和15外顯子熱點(diǎn)區(qū)域、PIK3CA基因第9和20外顯子熱點(diǎn)區(qū)域和NRAS基因第12、13及61密碼子突變狀態(tài),隨訪患者生存狀態(tài)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明KRAS基因突變率為37.89%(86/227),其中第12密碼子突變率為26.87%(61/227)、第13密碼子突變率為6.61%(15/227)、第61密碼子突變率為3.54%(8/226),BRAF基因突變率為7.02%(16/228),其中第11外顯子熱點(diǎn)區(qū)域突變率為1.75%(4/228),第15外顯子熱點(diǎn)區(qū)域突變率為5.26%(12/228),其中V600E突變?yōu)樽畛Ｒ姷念愋?43.75%,7/16),PIK3CA基因突變率為13.18%(29/220),其中第9外顯子熱點(diǎn)區(qū)域突變率為10.45%(23/220),第20外顯子熱點(diǎn)區(qū)域突變率為2.7%(6/221),NRAS基因突變只存在于Ⅱ期結(jié)腸癌中,突變率為0.89%(2/224),突變類型為G12D(1例)和Q61R(1例)。結(jié)合患者臨床資料分析表明KRAS和BRAF基因在60歲以上人群中突變率更高(P0.05),在Ⅲ期結(jié)腸癌中,PIK3CA基因第9外顯子(E545K)突變型和腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)(10.7% vs 0.0%,P=0.031)。生存分析表明PIK3CA基因第9外顯子(E545K)突變僅在Ⅲ期結(jié)腸癌中和患者較差的OS相關(guān)(P=0.044),而在DFS中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的趨勢(shì)(P=0.051)。其它基因突變狀態(tài)和患者生存之間沒有相關(guān)性。第二部分基于高通量測(cè)序技術(shù)的結(jié)腸癌患者預(yù)后和化療療效相關(guān)基因的篩選及驗(yàn)證腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素多步驟的復(fù)雜過(guò)程,涉及到多種基因突變累積和內(nèi)外環(huán)境的影響,新一代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)的蓬勃發(fā)展則為我們從基因組層面研究腫瘤提供了幫助。在接受術(shù)后輔助化療的結(jié)腸癌中,一直沒有合適的基因分子標(biāo)志物用于療效評(píng)價(jià)和預(yù)后評(píng)估,為此我們收集了20例預(yù)后不同的Ⅲ期結(jié)腸癌患者腫瘤組織進(jìn)行全外顯子組(whole exome sequencing, WES)測(cè)序,并擴(kuò)大樣本驗(yàn)證篩選的差異基因,探索可以用于預(yù)后評(píng)估的基因分子標(biāo)志。經(jīng)過(guò)WES測(cè)序和Sequenom檢測(cè)驗(yàn)證,我們發(fā)現(xiàn)了6個(gè)基因(CD97,ZNF568, WARS2, APPL2, C9orf117, ZNF443)的SNP位點(diǎn)在不同預(yù)后組間出現(xiàn)差異(P0.05),在擴(kuò)大樣本驗(yàn)證階段ZNF568 (rs547483)在不同預(yù)后組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異趨勢(shì)(P=0.08621),結(jié)合患者臨床特征分析表明在Ⅲ期結(jié)腸癌中WARS2基因(rs3790549, CC)在不吸煙患者中頻率較高(62.5% vs 35.3%,P=0.041)；在Ⅱ-Ⅲ期結(jié)腸癌中WARS2基因(rs3790549, CC)和C9orf117基因(rs497632, AC)在不吸煙患者中頻率較高(P0.05),且WARS2基因(rs3790549, CC)在腫瘤不同的T分期中頻率不同(P=0.023)。以上兩部分的研究?jī)?nèi)容在中國(guó)CRC患者中初步建立了PIK3CA和NRAS基因突變頻譜,分析了KRAS、BRAF、PIK3CA和NRAS基因與結(jié)腸癌患者臨床特征相關(guān)性并分析了其在預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值；同時(shí)利用WES測(cè)序技術(shù)篩選并探索了新型基因分子標(biāo)志物在結(jié)腸癌輔助化療中的評(píng)價(jià)作用。這些研究結(jié)果為我們更加深入的了解中國(guó)CRC患者和指導(dǎo)臨床實(shí)踐提供可靠的理論依據(jù)。
[Abstract]:In the early stage of colorectal cancer ( CRC ) , the mutation rate of PI3CA and NRAS was 7 . 0 % ( 62 / 621 ) , and the mutation rate of PI3CA and BRAF gene was 1.7 % ( 17 / 636 ) . The mutation rate of PI3CA and BRAF gene was 1.7 % ( 17 / 636 ) . The mutation rate of exon 12 , 13 and 61 , mutation rate of exon 12 , 13 and 61 , mutation rate of exon 12 , 13 and 61 of the exon 11 and exon 12 of the exon 12 , 13 and 61 of the exon 11 were 10.45 % ( 23 / 220 ) . The mutation rate of exon 11 was 3.54 % ( 8 / 226 ) . The mutation rate of exon 11 was 10.45 % ( 23 / 220 ) . We collected 20 cases of colon cancer patients with different prognosis and had no correlation between different prognostic groups ( P = 0.023 ) .

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.34
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本文編號(hào)：1535886