本文關(guān)鍵詞： 腎細胞癌 microRNA miR-495 SATB1　出處：《武漢大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景：腎細胞癌(RCC)是成人腎臟最常見的腫瘤類型,約占所有原發(fā)性腎腫瘤的85%,在成人所有腫瘤中的發(fā)病率約占3%。對于局限性早期腎癌可采取手術(shù)治療,然而,仍有許多患者會面臨腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險,因此預(yù)后多較差,伴有轉(zhuǎn)移的RCC患者,其5年生存率僅9%。為了治療這些晚期RCC患者,迫切需要發(fā)現(xiàn)新的、可作為治療靶點的生物標(biāo)志物。miRNAs是一類長約19-24個核苷酸,高度保守的調(diào)節(jié)分子,通過與靶基因mRNA的3‘非編碼區(qū)(3'UTR)的堿基序列互補配對后降解mRNA或抑制其翻譯,從而調(diào)節(jié)靶基因的表達水平。多項研究報道m(xù)iRNAs在發(fā)育調(diào)節(jié)；細胞增殖、分化、侵襲和凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中miR-495在多種腫瘤中均見有異常表達,如非小細胞肺癌、乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、胃癌和白血病等,可能作為抑癌基因或原癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要作用。但目前miR-495在腎細胞癌中的表達及其功能尚屬未知。目的：研究miR-495在人RCC中的表達情況,探討miR-495的表達水平對體外RCC細胞增殖、遷徙等活性的影響。通過預(yù)測miR-495的靶基因,驗證體外RCC細胞中miR-495異常表達對靶基因的調(diào)控作用,進一步探討miR-495調(diào)控RCC的可能分子機制。方法：選擇四種人RCC細胞系和一種正常人腎細胞系,qRT-PCR檢測各細胞系中miR-495的表達水平,另收集臨床腎癌和癌旁正常組織標(biāo)本,qRT-PCR檢測各組織標(biāo)本中miR-495的表達差異。通過瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)建立穩(wěn)定過表達miR-495的人腎癌786-0細胞系,利用qRT-PCR驗證穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系中miR-495的表達變化。進一步通過CCK8實驗檢測過表達miR-495后786-0細胞增殖活性的變化；流式細胞儀檢測過表達miR-495對786-o細胞周期的影響；劃痕實驗驗證過表達miR-495后786-0細胞遷徙能力的改變。通過檢索TargetScan等生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測了miR-495的靶基因SATB1,利用熒光素酶報告基因分析驗證miR-495是否與靶基因SATB1mRNA的3'UTR互補結(jié)合,并通過qRT-PCR和WB方法檢測人腎癌786-0細胞中miR-495對靶基因SATB1表達的抑制作用。為了進一步證實miR-495對人RCC細胞生物學(xué)活性的影響是通過其抑制靶基因SATB1表達實現(xiàn)的,通過SATB1表達載體的轉(zhuǎn)染使穩(wěn)定表達miR-495的786-0細胞中SATB1基因拯救性過表達,并利用WB驗證表達載體轉(zhuǎn)染后SATB1蛋白的表達水平,進一步利用CCK8、流式細胞和劃痕實驗檢測拯救性過表達SATB1基因?qū)τ诜�(wěn)定表達miR-495的786-0細胞增殖活性、細胞周期以及遷徙能力的影響。結(jié)果：qRT-PCR檢測結(jié)果顯示四種人RCC細胞系(769-P、786-o、A498和SN12-PM6)中miR-495的表達量均較人正常腎細胞系HK-2中降低,而四種RCC細胞之間,786-0細胞內(nèi)的miR-495表達水平相對最低。與癌旁正常組織相比,miR-495在臨床RCC組織標(biāo)本中的表達量也顯著降低。通過轉(zhuǎn)染人工合成的miR-495 mimics成功獲得穩(wěn)定表達miR-495的786-0細胞系,并利用qRT-PCR驗證了轉(zhuǎn)染后miR-495的表達水平明顯升高。細胞周期檢測顯示穩(wěn)定表達miR-495的786-0細胞多數(shù)細胞周期停滯在G0/G1期；CCK8檢測顯示穩(wěn)定表達miR-495可抑制786-0細胞的增殖活性；劃痕實驗顯示穩(wěn)定表達miR-495的786-0細胞遷徙活性也明顯受到抑制。通過檢索TargetScan6.2等相關(guān)數(shù)據(jù)庫均顯示,SATB1是miR-495可能的靶基因。熒光素酶報告基因檢測顯示在包含p-MIR-SATB1 (SATB1-3'UTR-WT)的786-0細胞中過表達miR-495可使熒光素酶報告基因的熒光值降低約67%,而轉(zhuǎn)染序列突變的p-MIR-SATB1 (SATB1-3'UTR-MUT)以及miR scramble對照組熒光素酶報告基因的熒光值沒有變化。證實miR-495與SATB1 mRNA的3'UTR可互補結(jié)合。而且,利用qRT-PCR和WB檢測證實了穩(wěn)定表達的miR-495可抑制786-0細胞中SATB1 mRNA和蛋白水平的表達。為了進一步證實miR-495對人RCC細胞生物學(xué)活性的影響是通過靶向SATB1基因?qū)崿F(xiàn)的,利用SATB1表達載體轉(zhuǎn)染使穩(wěn)定表達miR-495的786-0細胞中SATB1基因拯救性過表達,通過WB驗證了載體轉(zhuǎn)染后SATB1蛋白的表達明顯升高。CCK8檢測顯示過表達SATB1可回復(fù)由于穩(wěn)定表達miR-495對786-0細胞增殖活性的抑制作用；流式細胞檢測也顯示穩(wěn)定表達miR-495的786-0細胞在過表達SATB1后細胞周期明顯由G0/G1期進入到S期；劃痕實驗顯示過表達SATB1可回復(fù)因穩(wěn)定表達miR-495對786-0細胞遷徙能力的抑制作用。結(jié)論：miR-495可通過抑制SATB1表達在RCC中扮演抑癌基因的作用。miR-495對SATB1的直接作用可能提供了一個SATB1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的機制理論。miR-495有望作為將來RCC治療的作用靶點之一。
[Abstract]:Background: renal cell carcinoma (RCC) is the most common adult kidney tumor types, accounting for all primary renal tumors in 85% of all adult cancers in the incidence rate of about 3%. can be taken for surgical treatment, limitation of early renal cell carcinoma however, there are still many patients will face tumor recurrence and metastasis risk therefore, the prognosis is poor with metastasis in patients with RCC, the 5 year survival rate of 9%. for the treatment of these patients with advanced RCC, the urgent need to find new therapeutic targets, can be used as biomarkers of.MiRNAs is 19-24 nucleotides, highly conserved regulatory molecules by mRNA and target gene 3 "non encoding region (3'UTR) of the base sequence complementary after mRNA degradation or inhibit translation, thereby regulating the expression level of target genes. Many studies reported that miRNAs in the regulation of development; cell proliferation, differentiation, invasion and apoptosis play a key role in the miR. -495 in a variety of tumors were found to have abnormal expression, such as non-small cell lung cancer, breast cancer, malignant glioma, gastric cancer and leukemia, may act as a tumor suppressor genes or oncogenes play an important role in cancer development. But at present the expression of miR-495 in renal cell carcinoma and its function is unknown Objective: To investigate the expression of miR-495 in human RCC, to investigate the expression level of miR-495 on the proliferation of RCC cells in vitro, influence the migration activity. The target gene prediction of miR-495, verification of RCC cells in vitro in miR-495 abnormal expression regulation of the target genes for further study the possible molecular mechanism of miR-495 regulation of RCC.: four human RCC cell lines and a normal renal cell line, the expression level of miR-495 qRT-PCR was detected by cell lines, another collection of clinical renal cell carcinoma and adjacent normal tissues, qRT-PCR tissues were detected by The differential expression of miR-495. Through transient transfection technology to establish the stable over expression of miR-495 in human renal carcinoma cell line 786-0, the expression of miR-495 qRT-PCR to verify the stable transfection cell lines. Further changes in 786-0 by the CCK8 assay the cell proliferation activity of miR-495 expression after detection; overexpression of miR-495 effect on 786-o cell cycle by flow cytometry the scratch test verified; 786-0 cell migration miR-495 expression changes. By searching the TargetScan database of bioinformatics to predict the target gene SATB1 miR-495, analyzed by luciferase reporter to verify whether miR-495 and SATB1mRNA target gene 3'UTR complementary binding and through inhibition of miR-495 detection of human renal cell carcinoma qRT-PCR and WB 786-0 cells the target gene of SATB1. To further confirm the effect of miR-495 on the activity of RCC in cell biology is through The inhibition of SATB1 target gene expression, SATB1 786-0 cells by SATB1 vector transfection and expression of the stable expression of miR-495 gene in rescue over expression, and use WB to verify the expression level of SATB1 protein expression after transfection, further using CCK8, flow cytometry and scratch assay of overexpression of SATB1 gene for rescue 786-0 stable expression of miR-495 cell proliferation activity, cell cycle effects and migration ability. Results: qRT-PCR results showed that four kinds of human RCC cell lines (769-P, 786-o, A498 and SN12-PM6) expression in miR-495 were lower than that of normal human kidney cell line HK-2 decreased, and four kinds of RCC cells, 786-0 cells the expression level of miR-495 is the lowest. Compared with normal tissues, the expression of miR-495 in clinical RCC in the samples was also significantly decreased. By transfection of synthetic miR-495 mimics successfully obtained stability The expression of miR-495 786-0 cell lines, and the use of qRT-PCR to verify the expression level of miR-495 increased significantly after transfection. Cell cycle analysis showed that the expression of most G0/G1 cell cycle arrest in 786-0 stable miR-495 cells; CCK8 assay showed that the stable expression of miR-495 can inhibit the proliferation of the cells in 786-0; scratch test showed that stable expression of miR-495 gene in 786-0 cell migration the activity was also inhibited. By searching the TargetScan6.2 database show that SATB1 is the target gene of miR-495. Luciferase reporter gene assay showed that contain p-MIR-SATB1 (SATB1-3'UTR-WT) 786-0 cells that overexpressed miR-495 fluorescent luciferase reporter gene decreased about 67%, while transfection of the sequence of the p-MIR-SATB1 mutant (SATB1-3'UTR-MUT) and fluorescence the control group miR scramble luciferase reporter gene and confirmed that the miR-495 value does not change. SATB1 mRNA 3'UTR can be combined with complementary. Moreover, detected by qRT-PCR and WB confirmed the stable expression of miR-495 can inhibit the expression of SATB1 mRNA and protein levels in 786-0 cells. To further confirm the effect of miR-495 on the activity of RCC in cell biology is to achieve the target gene by SATB1 and SATB1 786-0 cells transfected to stable expression the use of miR-495 SATB1 gene in rescuing expression by WB to verify the expression of SATB1 protein increased significantly after transfection.CCK8 assay showed that the overexpression of SATB1 can reply due to stable expression of inhibitory effect of miR-495 on 786-0 cell proliferation; flow cytometry showed stable expression of miR-495 786-0 cells in the expression of cell cycle after SATB1 obviously from G0/G1 to S; the scratch test showed that overexpression of SATB1 can reply for stable expression of miR-495 in 786-0 cell migration inhibition ability Conclusion: miR-495 can inhibit the expression of SATB1 and play a role in tumor suppressor gene in RCC. The direct effect of.MiR-495 on SATB1 may provide a mechanism of SATB1 post transcriptional regulation..miR-495 is expected to be one of the targets of RCC therapy in the future.

【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.11

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本文編號：1534834