本文關(guān)鍵詞： CUL4B 肺癌 miR-194 miR-371-373 轉(zhuǎn)錄抑制　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：CUL4B作為骨架蛋白與DDB1、RBX1以及底物受體蛋白組成Cullin 4B-Ring E3泛素連接酶(Cullin 4B RING E3 ligases, CRL4B)。一方面,CUL4B功能缺失導(dǎo)致細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育、造血和神經(jīng)發(fā)生等多方面異常；另一方面,CUL4B在包括食管癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌及宮頸癌等多種實體腫瘤中表達(dá)上調(diào)。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),CRL4B通過單泛素化H2AK119,協(xié)同轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物PRC2、SUV39H1/HP1/DNMT3A以及Sin3A/HDAC等,通過調(diào)控組蛋白修飾和DNA甲基化,進(jìn)而調(diào)節(jié)包括p16、PTEN、p21、IGFBP3、Wnt/β-catenin在內(nèi)的多條信號通路,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。然而,CUL4B在肺癌中的作用以及腫瘤組織內(nèi)CUL4B表達(dá)上調(diào)的機(jī)制目前尚不明確。microRNA(miRNA)能夠通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR)互補(bǔ)結(jié)合,從而抑制靶mRNA翻譯。許多抑癌基因和癌基因都是miRNAs的靶基因,其異常表達(dá)往往導(dǎo)致腫瘤發(fā)生并且影響患者預(yù)后。最近的研究表明,miRN A本身也受到表觀遺傳調(diào)控,但是,調(diào)控miRNAs表達(dá)的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。鑒于CUL4B 和 miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色,本研究以肺癌細(xì)胞為研究對象,研究了CUL4B在肺癌發(fā)生中的作用以及CUL4B與miRNAs之間的調(diào)控作用。第一部分CUL4 B促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲c UL4B在多種腫瘤中高表達(dá)。但是,CUL4B在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用目前尚不明確。在本部分,我們分析了CUL4B在肺癌中的作用,取得如下結(jié)果：1)CUL4B在肺癌組織中表達(dá)上調(diào)：利用、Western blot分析方法,對收集的30對肺癌及其癌旁組織樣本中CUL4B表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。與前期在其他實體腫瘤組織中得到的結(jié)果一致,在66.6%(20/30)的癌組織中CUL4B表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。2)肺癌組織中CUL4B表達(dá)受轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控：為了進(jìn)一步研究CUL4B在肺癌中表達(dá)上調(diào)的機(jī)制,我們利用q-PCR檢測了30對肺癌組織標(biāo)本中CUL4B mRNA的表達(dá)水平,對比分析癌和癌旁組織中CUL4B蛋白和mRNA的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),CUL4B蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)水平變化與其mRNA表達(dá)水平表達(dá)變化不存在對應(yīng)關(guān)系,表明肺癌組織中CUL4B的表達(dá)上調(diào)受轉(zhuǎn)錄后機(jī)制調(diào)控。3) CUL4B促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長：CUL4B在肺癌組織中表達(dá)上調(diào)提示其可能發(fā)揮癌基因作用。因此我們檢測了干擾CUL4B對肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖的影響。MTT分析顯示,干擾CUL4B表達(dá)明顯抑制A549肺癌細(xì)胞增殖；利用裸鼠成瘤模型分析發(fā)現(xiàn)干擾CUL4B明顯抑制A549細(xì)胞株在裸鼠皮下形成的腫瘤生長。4) CUL4B促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲：劃痕實驗分析表明,低表達(dá)CUL4B抑制腫瘤細(xì)胞遷移；transwell分析顯示,干擾CUL4B表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞穿過轉(zhuǎn)移小室的能力與對照細(xì)胞相比明顯下降；transwell基底膜基質(zhì)膠侵襲實驗顯示干擾CUL4B導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲能力明顯減弱。第二部分miR-194調(diào)控肺癌細(xì)胞CUL4B表達(dá)上一部分結(jié)果顯示CUL4B在肺癌組織中的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控,提示miRNA可能在調(diào)控CUL4B表達(dá)方面發(fā)揮重要作用。為此,本部分我們分析了肺癌細(xì)胞中CUL4B表達(dá)上調(diào)的機(jī)制,取得了如下結(jié)果：1) miR-194可能作用于CUL4B 3'-UTR:我們利用3個不同的分析軟件(TargetScan, miRanda 和 miRDB))對 CUL4B mRNA3'-UTR序列進(jìn)行了分析,3個軟件分析都提示CUL4B可能是miR-194的靶基因；對結(jié)合序列分析顯示,miR-194在CUL4B 3'UTR上的結(jié)合位點在進(jìn)化上高度保守。這些結(jié)果提示CUL4B可能是miR-194的靶基因。2) miR-194直接結(jié)合CUL4B mRNA 3'-UTR調(diào)控CUL4B蛋白表達(dá)：為了確定miR-194對CUL4B調(diào)控作用,我們首先通過轉(zhuǎn)染miR-194 mimics和inhibitors檢測其對H1299和A549細(xì)胞CUL4B蛋白水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-194 mimics有效降低CUL4B蛋白水平,而niR-194 inhibitors處理能顯著增加CUL4B蛋白水平。為明確miR-194是否直接作用于CUL4B mRNA 3'-UTR,我們構(gòu)建了包含miR-194結(jié)合位點的CUL4B 3'-UTR熒光素酶報告載體及該位點突變的載體。我們將野生型載體、突變載體分別與miR-194 mimics、inhibitors以及對照RNA一起轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞,檢測熒光素酶報告載體的熒光素酶活性。結(jié)果表明,與對照RNA相比,niR-194 mimics明顯抑制野生型載體的熒光素酶活性,而miR-194 inhibitors則有效上調(diào)其熒光素酶活性。然而,miR-194 mimics與miR-194 inhibitors對突變載體的熒光素酶活性則沒有類似作用。另外,miRNA pulldown實驗證實miR-194 可以直接結(jié)合于 CUL4B mRNA的3'-UTR。3) miR-194通過抑制CUL4B蛋白表達(dá)影響肺癌細(xì)胞遷移：為了確定CUL4B是否是miR-194的下游效應(yīng)因子,我們利用拯救實驗檢測了CUL4B 在 miR-194所介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞遷移能力抑制中的作用。Transwell分析結(jié)果表明過表達(dá)CUL4B能有效拯救miR-194 mimics對肺癌細(xì)胞遷移能力的抑制作用。4) p53-miR-194通路參與調(diào)節(jié)CUL4B蛋白表達(dá)：由于p53可以作為轉(zhuǎn)錄因子與miR-194啟動子區(qū)域直接結(jié)合,促進(jìn)miR-194的轉(zhuǎn)錄,因此我們檢測了p53對于CUL4B表達(dá)的影響。與預(yù)期一致,p53缺失的肺癌細(xì)胞系H1299中CUL4B蛋白表達(dá)水平明顯高于p53野生型肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549。Nutlin-3處理細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)p53蛋白,p53野生型細(xì)胞A549經(jīng)Nutlin-3處理,細(xì)胞內(nèi)p53蛋白累積的同時CUL4B蛋白減少；但是當(dāng)Nutlin-3處理缺失p53的H1299細(xì)胞時,CUL4B蛋白水平并未發(fā)生變化。干擾p53蛋白表達(dá)進(jìn)一步證實其對CUL4B的負(fù)調(diào)控。為了進(jìn)一步確定p53調(diào)控CUL4B蛋白表達(dá)是由miR-194介導(dǎo),我們用Nutlin-3處理A549細(xì)胞,檢測了不同的時間點p53、CUL4B和miR-194的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CUL4B蛋白水平降低與miR-194的表達(dá)的升高具有時間對應(yīng)性。另外CUL4B 3'-UTR野生型載體熒光素酶的活性在p53缺失的細(xì)胞系H1299要高于p53野生型細(xì)胞系A(chǔ)549,而H1299細(xì)胞miR-194的表達(dá)要低于A549細(xì)胞。另外,突變載體的熒光素酶活性在兩種細(xì)胞之間沒有明顯差別。重要的是,利用miR-194 inhibitors阻斷了由于p53升高而引起的內(nèi)源miR-194的高表達(dá)后,熒光素酶活性及CUL4B蛋白減少的趨勢得到緩解。這些結(jié)果表明p53通過激活miR-194的轉(zhuǎn)錄而抑制CUL4B表達(dá)。5)miR-194在肺癌樣本中低表達(dá)并且與CUL4B表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)：我們利用q-PCR檢測了肺癌組織標(biāo)本中miR-194的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)63.3%(19/30)的肺癌標(biāo)本中,癌組織miR-194表達(dá)水平顯著低于癌旁組織。統(tǒng)計分析顯示肺癌標(biāo)本中CUL4B蛋白水平與miR-194表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。第三部分CUL4B與miR-194在肺癌細(xì)胞中形成雙重負(fù)反饋環(huán)為了進(jìn)一步研究CUL4B促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,我們利用高通量miRNA芯片對比分析了低表達(dá)CUL4B及對照A549細(xì)胞腫瘤相關(guān)niRNAs的表達(dá)水平,取得了如下結(jié)果：1)肺癌細(xì)胞中CUL4B在轉(zhuǎn)錄水平抑制miR-194的表達(dá)：芯片分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-194基因簇(miR-192-194-2和miR-215-194-1)家族成員在CUL4B低表達(dá)的細(xì)胞中表達(dá)升高。通過q-PCR我們在H1299和A549細(xì)胞對芯片結(jié)果進(jìn)行了驗證,同時發(fā)現(xiàn)miR-194基因簇的前體pri-miR-194-1/2在CUL4B低表達(dá)的細(xì)胞也顯著升高,說明CUL4B在轉(zhuǎn)錄水平抑制miR-194前體合成。2) CUL4B直接結(jié)合在miR-194基因簇啟動子區(qū)域并抑制miR-194基因簇表達(dá)：為了明確CUL4B制miR-194表達(dá)的分子機(jī)制,我們利用ChIP實驗檢測CUL4B及其底物H2AK119ub1在miR-192-194-2和miR-215-194-1基因簇啟動子區(qū)域結(jié)合情況,結(jié)果顯示CUL4B和H2AK119ub1共同結(jié)合于miR-192-194-2和miR-215-194-1基因簇啟動子TSS上游區(qū)域,q-ChIP結(jié)果顯示在低表達(dá)CUL4B的H1299細(xì)胞中,CUL4B及其底物H2AK119ub1在iR-192-194-2和miR-215-194-1基因簇的啟動子TSS上游區(qū)域結(jié)合明顯減少。與我們前期結(jié)果一致EZH2、H3K27me3在這一區(qū)域的結(jié)合也相應(yīng)減少,說明CUL4B通過單泛素化H2A招募EZH2進(jìn)而對H3K27進(jìn)行甲基化修飾,共同抑制mmiR-192-194-2和miR-215-194-1基因簇的轉(zhuǎn)錄。3) CUL4B與miR-194之間形成雙重負(fù)反饋環(huán)：CUL4B可以抑制miR-194表達(dá),同時CUL4B又是miR-194的靶基因,提示二者之間可能形成雙重負(fù)反饋環(huán)。為了驗證以上假設(shè),我們將miR-194 mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)源的pri-miR-194-1、pri-miR-194-2的表達(dá)升高,同時成熟miR-192和miR-215的表達(dá)也升高。拯救實驗證明轉(zhuǎn)染外源的CUL4B表達(dá)載體可以抑制niR-194 mimics導(dǎo)致的pri-miR-194-1、pri-miR-194-2轉(zhuǎn)錄激活。這些結(jié)果表明CUL4B與 miR-194之間形成相互抑制的雙重負(fù)反饋環(huán)。4) CUL4B通過抑制miR-194進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)程：因為CUL4B抑制miR-194的表達(dá),因此我們猜測miR-194的靶蛋白在CUL4B低表達(dá)的細(xì)胞中表達(dá)會降低。與預(yù)期一致,當(dāng)干擾CUL4B蛋白表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)miR-194的靶蛋白RBX1和CDH2的蛋白水平及它們的3'-UTR熒光素酶報告載體活性都顯著降低,拯救實驗證明CUL4B可以正向調(diào)控RBX1和CDH2的蛋白表達(dá)。熒光素酶報告載體實驗證明CUL4B可以通過miR-194在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控RBX1和CDH2的蛋白表達(dá)。劃痕實驗和transwell侵襲實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-194 inhibitors能有效緩解由于CUL4B表達(dá)而引起的H1299細(xì)胞遷移能力的抑制。以上實驗結(jié)果表明CUL4B對于肺癌發(fā)生的影響是部分是通過抑制miR-194實現(xiàn)的。第四部分CUL4B復(fù)合物通過抑制miR-371-373基因簇上調(diào)CDK2蛋白表達(dá)除了miR-194外,miR-371/372/373在CUL4 B表達(dá)的A549細(xì)胞表達(dá)水平也顯著升高。因此,本部分我們對CUL4B調(diào)節(jié)miR-371-373基因簇的機(jī)制進(jìn)行了分析,取得了以下結(jié)果：1) CUL4B負(fù)調(diào)控miR-371-373基因簇家族成員表達(dá)：q-PCR結(jié)果顯示在低表達(dá)CUL4B的H1299、A549和HeLa細(xì)胞系中,miRNA-371-373基因簇家族成員的表達(dá)水平顯著升高,而在高表達(dá)CUL4B的細(xì)胞中,這些miRNAs的表達(dá)水平顯著降低。2) CUL4B負(fù)調(diào)控miR-371-373基因簇的轉(zhuǎn)錄：我們接著檢測了pri-miR-371-373的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在低表達(dá)CUL4B的H1299、A549和HeLa細(xì)胞中,pri-miR-371-373表達(dá)水平顯著升高,而高表達(dá)CUL4B則導(dǎo)致pri-miR-371-373的表達(dá)水平顯著降低。這些結(jié)果證明CUL4B在轉(zhuǎn)錄水平抑制miR-371-373基因簇的表達(dá)。3)CUL4B直接結(jié)合在miR-371-373基因簇啟動子區(qū)域并抑制miR-371-373基因簇表達(dá)：ChIP實驗結(jié)果表明CUL4B及其底物H2AK119ub1可以在miR-371-373基因簇啟動子區(qū)域直接結(jié)合。定量ChIP分析發(fā)現(xiàn),抑制CUL4B表達(dá)導(dǎo)致CUL4B、EZH2. H2AK119ub1和H3K27me3#miR-371-373基因簇的啟動子區(qū)域的結(jié)合明顯減少。這表明CUL4B通過單泛素化H2A招募EZH2進(jìn)而對H3K27進(jìn)行甲基化修飾而抑制miR-371-373基因簇的轉(zhuǎn)錄。4)CUL4B通過抑制miR-372/3轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)CDK2蛋白的表達(dá)：miR-372/3可以抑制CDK2的翻譯。因此我們對CUL4B-miR-372/3-CDK2調(diào)控通路進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),抑制CUL4B表達(dá)導(dǎo)致CDK2蛋白表達(dá)降低。相反,過表達(dá)CUL4B導(dǎo)致CDK2蛋白表達(dá)上調(diào)。轉(zhuǎn)染miR-372/3 inhibitors可以抑制由于CUL4B低表達(dá)而引起的CDK2蛋白表達(dá)下調(diào)。同樣熒光素酶實驗分析表明低表達(dá)CUL4B顯著降低野生型CDK23'-UTR熒光素酶報告載體的熒光素酶活性,而對突變載體沒有影響。這些結(jié)果證明CUL4B通過抑制miR-371-373基因簇的表達(dá)上調(diào)CDK2。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
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本文編號：1534812