本文關鍵詞： 大腸癌 抗體芯片 RANTES/CCL5 ELISA 免疫組織化學　出處：《山東大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：大腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤,也是癌癥死亡的第四大常見原因。飲酒、吸煙及飲食結構的改變使得中國人群大腸癌的發(fā)病率逐年上升,且越來越年輕化。約50%的患者進展為遠處臟器轉移,需要手術切除和／或系統(tǒng)性治療。現(xiàn)已被證明有確切療效的藥物分為細胞毒性(如經典化療)和靶向藥物,其中靶向藥物治療成為晚期大腸癌病人最有希望且毒副作用小的治療方法。盡管目前關于大腸癌發(fā)生相關的信號通路方面已經做了許多研究,但是有助于判斷預后的生物指標及可利用的治療靶基因仍然很少。因此尋找新的治療靶點進行個體化治療仍然是眾學者不斷探索研究的目標之一。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中,其細胞內會發(fā)生一系列蛋白質表達的變化。而蛋白質組分析技術的應用,能夠從細胞整體水平上顯示出腫瘤在發(fā)生、進展過程中蛋白質表達譜的變化,有助于進一步認識腫瘤的發(fā)生機理,從而加快對腫瘤分子標志物以及腫瘤靶向治療中的關鍵因素--靶基因的尋找速度。蛋白質芯片是一種具有高通量、高效及快捷等特點的蛋白質組學研究技術手段,它的出現(xiàn)為開展腫瘤蛋白質組學研究提供了強有力的技術平臺。抗體芯片是蛋白芯片的一種,同樣具有微型化、集成化和高通量等特點,可以用于檢測某一特定的生理過程或者病理過程中相關蛋白質的表達譜,主要用于蛋白質組學、腫瘤、信號轉導及其他病變的相關性研究。盡管日本學者已經應用RayBioTM公司.AAH-BLM-1-2抗體芯片分別分析了結腸癌及直腸癌蛋白質的表達譜變化,但其并未對檢測結果進一步驗證。并且,抗體芯片技術分析的只是蛋白質的抽提物,即只能顯示是哪些蛋白質表達異常,而并不能提供是哪一類細胞(腫瘤上皮細胞還是間質細胞)異常表達這些蛋白質。本實驗旨在應用一種新的抗體芯片(含274種細胞重要功能蛋白,包括趨化因子、細胞因子、生長因子、溶解酶、血管生成因子及可溶性受體等)采用雙抗體夾心法檢測結直腸腺癌組織混合樣品與正常結直腸黏膜組織混合樣品差異表達蛋白質的表達水平,為大腸癌篩選出新的表達異常的蛋白質,從而為大腸癌的早期診斷、判斷預后、靶向治療及療效評估提供新的分子標志物。通過大量文獻復習,發(fā)現(xiàn)趨化因子在腫瘤中的作用越來越得到研究者的關注,本研究從抗體芯片的分析結果中,選擇一種具有代表性的異常表達的趨化因子-RANTES/CCL5,增加樣本量后采用ELISA法進行驗證,又采用免疫組化染色法檢測了CCL5在大腸癌中的表達部位并進一步評估其與臨床病理參數(shù)間的關系。研究目的1、檢測大腸癌組織中蛋白質表達的差異改變,篩選出癌組織中差異表達的蛋白質。2、從差異表達的蛋白質中挑選一種候選細胞因子RANTES/CCL5,增加樣本量檢測大腸癌組織及其對應的正常腸黏膜組織中該細胞因子的表達水平,從而驗證抗體芯片的檢測結果。3、檢測大腸癌組織及其對應的正常腸黏膜組織石蠟標本差異蛋白質CCL5的表達情況,觀察其與臨床病理參數(shù)的關系,探討其在癌組織表達的意義。材料和方法1、選取4例患者大腸癌組織及其正常大腸黏膜組織,應用抗體芯片AAH-CYT-G6-G10(含274種細胞重要功能蛋白)篩選大腸癌組織與其正常結直腸黏膜組織差異表達的蛋白質。以兩樣本間標準化雜交熒光信號強度差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)作為標準,篩選在大腸癌組織與正常大腸黏膜組織間差異表達的蛋白群。2、從抗體芯片所篩選的差異表達的蛋白質中選出最有研究價值的細胞因子RANTES/CCL5,采用ELISA法進行驗證。選取38例患者大腸癌組織及其正常大腸黏膜組織新鮮標本,制備組織勻漿,稀釋后離心取上清,與ELISA板上的包被抗體反應,孵育后加入酶標記抗體以及底物顯色,ELISA檢測儀測各反應孔的O·D值。3、使用免疫組織化學染色的方法檢測大腸癌組織及其正常腸黏膜組織石蠟標本中CCL5的表達。選取60例患者大腸癌組織與其對應的正常腸黏膜組織,行免疫組織化學染色(SP兩步法),Fast Red顯色,判讀染色結果,觀察CCL5的表達與臨床病理參數(shù)間的關系。結果1、抗體芯片檢測274種蛋白質在大腸癌組織及正常結直腸黏膜中的表達,有25種蛋白質表達組間比較具有統(tǒng)計學意義。其中有11種蛋白質表達明顯下調,包括SCF、CCL28、GRO、sTNF-RI、TIMP、VEGF-D、LYVE-1、NCAM-1、XEDAR、PSA-free,14種蛋白質表達明顯上調,包括EGF、FGF-7、MCP-2、MDC、RANTES、IL-2Rapha、 MIP-lbeta、E-Selection、Fas Ligand、IP-10、MMP13、Trappin-2、TIMP2、VEGF。2、ELISA結果顯示,大腸癌組織中CCL5蛋白濃度為157.50±89.88mg/ml,高于與其對應正常腸黏膜組織114.02±75.57(P=0.037)。3、免疫組化結果顯示：在結直癌組織中,腫瘤細胞高表達CCL5,癌旁正常腸黏膜上皮細胞可見弱表達。腫瘤細胞高表達CCL5與淋巴結轉移、高腫瘤分期有關(p0.05),而與性別、年齡、發(fā)病部位(直腸或結腸)、腫瘤大小、分化程度及血漿CEA蛋白水平不相關。結論1、抗體芯片能夠大范圍檢測蛋白質的表達水平,從而為腫瘤篩選新的分子標志物。2、CCL5在大腸癌細胞中高表達,說明CCL5可能成為一種有助于進一步了解大腸癌發(fā)病機制的新的靶蛋白。3、CCL5在大腸癌細胞中的表達與淋巴結轉移及高腫瘤分期有關,提示CCL5可能促進了腫瘤的侵襲性生長。4、CCL5作為潛在的癌組織轉移的分子標志物以及是否能夠成為新的靶向治療目標需進一步進行體內及體外研究。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34

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本文編號：1527390