本文關(guān)鍵詞： 大腸癌 抗體芯片 RANTES/CCL5 ELISA 免疫組織化學(xué)　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：大腸癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,也是癌癥死亡的第四大常見(jiàn)原因。飲酒、吸煙及飲食結(jié)構(gòu)的改變使得中國(guó)人群大腸癌的發(fā)病率逐年上升,且越來(lái)越年輕化。約50%的患者進(jìn)展為遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移,需要手術(shù)切除和／或系統(tǒng)性治療�，F(xiàn)已被證明有確切療效的藥物分為細(xì)胞毒性(如經(jīng)典化療)和靶向藥物,其中靶向藥物治療成為晚期大腸癌病人最有希望且毒副作用小的治療方法。盡管目前關(guān)于大腸癌發(fā)生相關(guān)的信號(hào)通路方面已經(jīng)做了許多研究,但是有助于判斷預(yù)后的生物指標(biāo)及可利用的治療靶基因仍然很少。因此尋找新的治療靶點(diǎn)進(jìn)行個(gè)體化治療仍然是眾學(xué)者不斷探索研究的目標(biāo)之一。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中,其細(xì)胞內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。而蛋白質(zhì)組分析技術(shù)的應(yīng)用,能夠從細(xì)胞整體水平上顯示出腫瘤在發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程中蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化,有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)腫瘤的發(fā)生機(jī)理,從而加快對(duì)腫瘤分子標(biāo)志物以及腫瘤靶向治療中的關(guān)鍵因素--靶基因的尋找速度。蛋白質(zhì)芯片是一種具有高通量、高效及快捷等特點(diǎn)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)手段,它的出現(xiàn)為開(kāi)展腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)平臺(tái)�？贵w芯片是蛋白芯片的一種,同樣具有微型化、集成化和高通量等特點(diǎn),可以用于檢測(cè)某一特定的生理過(guò)程或者病理過(guò)程中相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)譜,主要用于蛋白質(zhì)組學(xué)、腫瘤、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其他病變的相關(guān)性研究。盡管日本學(xué)者已經(jīng)應(yīng)用RayBioTM公司.AAH-BLM-1-2抗體芯片分別分析了結(jié)腸癌及直腸癌蛋白質(zhì)的表達(dá)譜變化,但其并未對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。并且,抗體芯片技術(shù)分析的只是蛋白質(zhì)的抽提物,即只能顯示是哪些蛋白質(zhì)表達(dá)異常,而并不能提供是哪一類(lèi)細(xì)胞(腫瘤上皮細(xì)胞還是間質(zhì)細(xì)胞)異常表達(dá)這些蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)旨在應(yīng)用一種新的抗體芯片(含274種細(xì)胞重要功能蛋白,包括趨化因子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、溶解酶、血管生成因子及可溶性受體等)采用雙抗體夾心法檢測(cè)結(jié)直腸腺癌組織混合樣品與正常結(jié)直腸黏膜組織混合樣品差異表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,為大腸癌篩選出新的表達(dá)異常的蛋白質(zhì),從而為大腸癌的早期診斷、判斷預(yù)后、靶向治療及療效評(píng)估提供新的分子標(biāo)志物。通過(guò)大量文獻(xiàn)復(fù)習(xí),發(fā)現(xiàn)趨化因子在腫瘤中的作用越來(lái)越得到研究者的關(guān)注,本研究從抗體芯片的分析結(jié)果中,選擇一種具有代表性的異常表達(dá)的趨化因子-RANTES/CCL5,增加樣本量后采用ELISA法進(jìn)行驗(yàn)證,又采用免疫組化染色法檢測(cè)了CCL5在大腸癌中的表達(dá)部位并進(jìn)一步評(píng)估其與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。研究目的1、檢測(cè)大腸癌組織中蛋白質(zhì)表達(dá)的差異改變,篩選出癌組織中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。2、從差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中挑選一種候選細(xì)胞因子RANTES/CCL5,增加樣本量檢測(cè)大腸癌組織及其對(duì)應(yīng)的正常腸黏膜組織中該細(xì)胞因子的表達(dá)水平,從而驗(yàn)證抗體芯片的檢測(cè)結(jié)果。3、檢測(cè)大腸癌組織及其對(duì)應(yīng)的正常腸黏膜組織石蠟標(biāo)本差異蛋白質(zhì)CCL5的表達(dá)情況,觀察其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系,探討其在癌組織表達(dá)的意義。材料和方法1、選取4例患者大腸癌組織及其正常大腸黏膜組織,應(yīng)用抗體芯片AAH-CYT-G6-G10(含274種細(xì)胞重要功能蛋白)篩選大腸癌組織與其正常結(jié)直腸黏膜組織差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。以?xún)蓸颖鹃g標(biāo)準(zhǔn)化雜交熒光信號(hào)強(qiáng)度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)作為標(biāo)準(zhǔn),篩選在大腸癌組織與正常大腸黏膜組織間差異表達(dá)的蛋白群。2、從抗體芯片所篩選的差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中選出最有研究?jī)r(jià)值的細(xì)胞因子RANTES/CCL5,采用ELISA法進(jìn)行驗(yàn)證。選取38例患者大腸癌組織及其正常大腸黏膜組織新鮮標(biāo)本,制備組織勻漿,稀釋后離心取上清,與ELISA板上的包被抗體反應(yīng),孵育后加入酶標(biāo)記抗體以及底物顯色,ELISA檢測(cè)儀測(cè)各反應(yīng)孔的O·D值。3、使用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)大腸癌組織及其正常腸黏膜組織石蠟標(biāo)本中CCL5的表達(dá)。選取60例患者大腸癌組織與其對(duì)應(yīng)的正常腸黏膜組織,行免疫組織化學(xué)染色(SP兩步法),Fast Red顯色,判讀染色結(jié)果,觀察CCL5的表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。結(jié)果1、抗體芯片檢測(cè)274種蛋白質(zhì)在大腸癌組織及正常結(jié)直腸黏膜中的表達(dá),有25種蛋白質(zhì)表達(dá)組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中有11種蛋白質(zhì)表達(dá)明顯下調(diào),包括SCF、CCL28、GRO、sTNF-RI、TIMP、VEGF-D、LYVE-1、NCAM-1、XEDAR、PSA-free,14種蛋白質(zhì)表達(dá)明顯上調(diào),包括EGF、FGF-7、MCP-2、MDC、RANTES、IL-2Rapha、 MIP-lbeta、E-Selection、Fas Ligand、IP-10、MMP13、Trappin-2、TIMP2、VEGF。2、ELISA結(jié)果顯示,大腸癌組織中CCL5蛋白濃度為157.50±89.88mg/ml,高于與其對(duì)應(yīng)正常腸黏膜組織114.02±75.57(P=0.037)。3、免疫組化結(jié)果顯示：在結(jié)直癌組織中,腫瘤細(xì)胞高表達(dá)CCL5,癌旁正常腸黏膜上皮細(xì)胞可見(jiàn)弱表達(dá)。腫瘤細(xì)胞高表達(dá)CCL5與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高腫瘤分期有關(guān)(p0.05),而與性別、年齡、發(fā)病部位(直腸或結(jié)腸)、腫瘤大小、分化程度及血漿CEA蛋白水平不相關(guān)。結(jié)論1、抗體芯片能夠大范圍檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,從而為腫瘤篩選新的分子標(biāo)志物。2、CCL5在大腸癌細(xì)胞中高表達(dá),說(shuō)明CCL5可能成為一種有助于進(jìn)一步了解大腸癌發(fā)病機(jī)制的新的靶蛋白。3、CCL5在大腸癌細(xì)胞中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高腫瘤分期有關(guān),提示CCL5可能促進(jìn)了腫瘤的侵襲性生長(zhǎng)。4、CCL5作為潛在的癌組織轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物以及是否能夠成為新的靶向治療目標(biāo)需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)及體外研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.34

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本文編號(hào)：1527390