本文關(guān)鍵詞： 抗菌肽 牛骨髓抗菌肽-28 蜂毒肽 改造體TT-1 甲狀腺髓樣癌 抗腫瘤　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,其中約5%-10%左右為來源于濾泡旁細(xì)胞的甲狀腺髓樣癌(Medullary Thyroid Carcinoma,MTC)。MTC的惡性程度介于分化型甲狀腺癌與未分化癌之間,具有惡性程度較高、病情進(jìn)展較快、術(shù)后易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì),50%-80%MTC的首發(fā)臨床表現(xiàn)包括頸部轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)腫大;對(duì)于臨床確診的MTC,約有超過20%存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前,手術(shù)切除仍是臨床MTC的首選治療方式,但術(shù)后復(fù)發(fā)率及患者的遠(yuǎn)期生存率并未得到較大的提高,并且,多數(shù)患者在術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)病情較重,已喪失手術(shù)治療機(jī)會(huì)。而放射性碘治療對(duì)MTC無治療作用,放療及化療等效果均不佳。近幾年來出現(xiàn)的分子靶向治療、腫瘤疫苗、單克隆抗體、自殺基因或免疫基因治療等各種生物免疫治療方法,已經(jīng)在臨床上或臨床前試驗(yàn)中取得了一定的療效,但效果并不理想。因此,我們需為甲狀腺髓樣癌的治療尋找一種更加有效的治療措施。抗菌肽(AMPs)是廣泛存在于微生物、植物和動(dòng)物中的天然多肽,并且被認(rèn)為是先天性免疫的必要組成成分�？咕木哂袕V泛的生物活性,如抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒等。最新研究顯示,陽離子抗菌肽可以選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞,而對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞無害,使其成為近期研究熱點(diǎn)。但抗菌肽對(duì)甲狀腺癌的抗腫瘤效果如何,未見相關(guān)報(bào)道。本研究選取抗菌肽中具有明顯抗腫瘤作用的牛骨髓抗菌肽-28(BMAP-28)及蜂毒肽(Melittin),通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了他們對(duì)甲狀腺髓樣癌的抗腫瘤效果,取得以下結(jié)果:1 BMAP-28對(duì)人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞系TT體內(nèi)外均具有明顯抗腫瘤活性1.1 BMAP-28體外能夠顯著抑制TT細(xì)胞的生長,并且呈劑量依賴和時(shí)間依賴關(guān)系。AV-PI雙染細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)表明,多肽BMAP-28能夠誘導(dǎo)TT細(xì)胞的凋亡作用,在BMAP-28濃度為1、2、4μM時(shí),TT細(xì)胞的凋亡率分別為6.51%、14.63、15.32%。機(jī)理研究顯示BMAP-28能夠上調(diào)TT細(xì)胞內(nèi)caspase-3及caspase-9蛋白表達(dá)并提高二者的m RNA水平。此外,對(duì)BMAP-28作用后TT細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)的MMP-3和MMP-9的檢測(cè)結(jié)果顯示,BMAP-28抑制TT細(xì)胞MMP-3和MMP-9蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯。1.2 BMAP-28體內(nèi)能夠顯著抑制甲狀腺髓樣癌細(xì)胞系TT裸鼠皮下移植瘤的生長。模型組移植瘤的體積隨時(shí)間的延長而增加,多肽BMAP-28高中低劑量組(1mg/kg、0.50 mg/kg、0.25mg/kg)的瘤體積與模型組相比明顯較小。與模型組相比,多肽BMAP-28給藥組的瘤重劑量依賴性下調(diào),BMAP-28 0.25、0.5、1mg/kg三個(gè)劑量組的抑瘤率為30%、34.29%、55.71%。BMAP-28能夠顯著抑制TT細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長,體內(nèi)抗腫瘤活性明顯。2 Melittin體外顯著抑制TT細(xì)胞的生長,其改造體TT-1與Melittin相比極大的節(jié)約了成本,提高了穩(wěn)定性,降低了毒性。2.1不同劑量(0,0.5,1,2,4,8,16,32μM)的Melittin與TT細(xì)胞作用48h后,MTT檢測(cè)細(xì)胞活率顯示Melittin顯著抑制TT細(xì)胞的生長,與BMAP-28組比,Melittin抑制TT細(xì)胞生長更明顯。2.2因抗菌肽具有產(chǎn)量低,成本高及穩(wěn)定性較差的特點(diǎn),限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。因此,我們對(duì)上述試驗(yàn)中對(duì)抗TT細(xì)胞活性較好的Melittin進(jìn)行改造,在Melittin已知分子結(jié)構(gòu)特征的基礎(chǔ)上,利用生物信息學(xué)手段,設(shè)計(jì)得到僅含11個(gè)氨基酸的新抗菌肽TT-1,相較其母肽極大的節(jié)約了成本。改造體TT-1不僅保留了Melittin氨基末端區(qū)域的活性位點(diǎn),并將原有不穩(wěn)定的氨基酸脯氨酸替換為帶有正電荷的賴氨酸,TT-1的疏水距與疏水性均增加,提示他的活性增強(qiáng),穩(wěn)定性增加;TT-1的電荷比Melittin有所減少,意味著它的毒性會(huì)有所降低。3 TT-1對(duì)人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞系TT體內(nèi)外均具有明顯抗腫瘤活性3.1 TT-1對(duì)人正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori3-1無明顯的細(xì)胞毒作用,但能夠特異性的殺傷TT細(xì)胞。AV-PI雙染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TT-1體外可誘導(dǎo)TT的凋亡。對(duì)TT-1作用后TT細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)的caspase-3、caspase-9、Bax和Bcl-2轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,TT-1激活促凋亡蛋白caspase-3、caspase-9、Bax并下調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl-2。3.2 TT-1顯著抑制人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞系TT裸鼠皮下移植瘤的生長。模型組移植瘤的腫瘤體積隨時(shí)間的延長而增加,TT-1高、中劑量組(1mg/kg、0.2mg/kg)的瘤體積與模型組相比明顯較小。TT-1低劑量組(0.04mg/kg)的瘤體積與模型組相當(dāng)。多肽TT-1高、中劑量組(1mg/kg、0.2 mg/kg)的瘤質(zhì)量與模型組相比明顯較小,且具有顯著性差異(**P0.01)。TT-1三個(gè)劑量組1mg/kg、0.2mg/kg、0.04mg/kg對(duì)應(yīng)的抑瘤率為56.8%、48.6%、5.8%。綜上所述,本論文首創(chuàng)性地研究了陽離子抗菌肽BMAP-28、Melittin對(duì)人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞系TT的抗腫瘤活性。通過體內(nèi)外試驗(yàn)研究,闡述了BMAP-28抗甲狀腺髓樣癌的作用機(jī)理,并證實(shí)其作用效果。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Melittin抑制TT細(xì)胞的生長較BMAP-28更明顯。同時(shí),通過對(duì)Melittin的改良設(shè)計(jì)得到同樣具有抗TT細(xì)胞活性的新型陽離子抗菌肽TT-1,不僅節(jié)約了成本,提高穩(wěn)定性,而且還降低了毒性,為甲狀腺髓樣癌的治療策略提供了新的方向。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R736.1

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1 張大奇;BMAP-28、TT-1對(duì)人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞系TT的抗腫瘤作用及其機(jī)理研究[D];吉林大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1522728