本文關(guān)鍵詞： 肝癌 癌前病變 微小RNA I型干擾素 H3K27Ac CYP3A5 肝細(xì)胞癌 蛋白激酶B m TORC2 活性氧族　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分肝臟癌前病變的發(fā)生機(jī)制研究研究背景和目的:世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)在1978年首次明確定義癌前病變(Precancerous Lesions)為“一種更容易發(fā)生惡性腫瘤的組織學(xué)改變”。癌前病變發(fā)生惡性腫瘤的風(fēng)險顯著高于其他組織,但并非所有的癌前病變均會進(jìn)展為惡性腫瘤。高級別不典型增生結(jié)節(jié)(High Grade Dysplastic Nodules,HGDN)是肝癌的癌前病變,HGDN是指“肝組織有異型增生但又未達(dá)到惡性腫瘤標(biāo)準(zhǔn),具有高度惡性潛能的,直徑1mm以上的不典型增生結(jié)節(jié)”。HGDN是一種真正處于良惡性臨界狀態(tài)的肝組織,其進(jìn)展為肝癌的風(fēng)險顯著高于其它非惡性結(jié)節(jié),如增生性大結(jié)節(jié)(Large Regenerative Nodules,LRN)、低級別不典型增生結(jié)節(jié)(Low Grade Dysplastic Nodules,LGDN)等。據(jù)統(tǒng)計(jì),HGDN患者發(fā)生肝癌的風(fēng)險是LGDN的四倍,其五年內(nèi)進(jìn)展為肝癌的風(fēng)險高達(dá)60-80%。由此可知,HGDN是調(diào)控肝臟惡性腫瘤發(fā)生的一個關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),如果能有效控制甚至逆轉(zhuǎn)HGDN,那么就能大大降低肝癌的發(fā)病率。但是,目前與肝臟癌前病變相關(guān)的研究少之又少,其具體發(fā)生機(jī)制仍然鮮為人知。因此,我們希望通過對HGDN的形成,以及HGDN進(jìn)展為肝癌的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究,尋找控制甚至逆轉(zhuǎn)HGDN的分子靶標(biāo),以期最終能夠降低肝癌的發(fā)病率。研究方法:1.精準(zhǔn)獲取臨床HGDN組織樣本:運(yùn)用激光捕獲顯微切割技術(shù)(Laser Capture Microdissection,LCM)精準(zhǔn)割取同一患者肝臟石蠟樣本中的正常組織、HGDN組織和肝癌組織。2.HGDN組織中micro RNA表達(dá)譜鑒定:抽提LCM所獲取肝組織中的micro RNA,利用micro RNA低密度表達(dá)譜芯片檢測正常組織、HGDN組織和肝癌組織中的micro RNA表達(dá)特點(diǎn);運(yùn)用micro RNA動態(tài)網(wǎng)絡(luò)標(biāo)志物分析技術(shù)(Dynamic Network Biomarker Analysis,DNB)篩選出HGDN中異常表達(dá)的micro RNA。3.研究目標(biāo)micro RNA在正常肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的生物學(xué)功能:通過soft-agar克隆形成實(shí)驗(yàn)、皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)、retrorsine小鼠肝細(xì)胞原位移植實(shí)驗(yàn)、分選DEN誘癌小鼠原代HGDN細(xì)胞荷瘤實(shí)驗(yàn)、尾靜脈注射antagomir實(shí)驗(yàn)以及相關(guān)標(biāo)志物檢測等,深入研究目標(biāo)micro RNA在肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的相關(guān)功能。4.構(gòu)建相關(guān)基因敲除小鼠并建立誘癌模型:我們構(gòu)建了mi R-484組成型敲除小鼠(mi R-484-/-),并購買了Ⅰ型干擾素受體組成型敲除小鼠(Ifnar1-/-);通過對上述小鼠進(jìn)行DEN誘癌,進(jìn)一步研究mi R-484和Ⅰ型干擾素信號通路在肝臟癌前病變形成和肝癌發(fā)生過程中的功能及意義。5.機(jī)制探索:運(yùn)用熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)、報告基因?qū)嶒?yàn)、ELISA實(shí)驗(yàn)、Ch IP實(shí)驗(yàn)、相關(guān)抑制劑實(shí)驗(yàn)、基因敲除細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及敲除小鼠體內(nèi)試驗(yàn)等,深入研究mi R-484調(diào)控肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和HGDN形成的具體分子機(jī)制。6.臨床印證:通過一系列的免疫組化實(shí)驗(yàn)、ELISA實(shí)驗(yàn)以及原位雜交實(shí)驗(yàn),印證本研究中相關(guān)基因在臨床樣本和小鼠DEN誘癌樣本中的表達(dá)情況。研究結(jié)果:1.明確了肝臟癌前病變中micro RNA的表達(dá)特征,發(fā)現(xiàn)mi R-449b,mi R-545,mi R-484,mi R-320,mi R-625#,mi R-661和mi R-29a#等在HGDN中異常高表達(dá)。2.發(fā)現(xiàn)mi R-484能誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化并增強(qiáng)其成瘤能力。3.DEN誘癌時下調(diào)mi R-484能通過抑制癌前病變的形成影響肝癌的發(fā)生。4.mi R-484-/-小鼠DEN誘癌發(fā)現(xiàn)癌前病變的形成和肝癌的發(fā)生均顯著減少。5.持續(xù)低劑量的Ⅰ型干擾素(IFN-I)依賴于mi R-484啟動子區(qū)的H3K27高乙�；�(H3K27Ac)作用,選擇性誘導(dǎo)mi R-484表達(dá);而異常高表達(dá)的mi R-484能進(jìn)一步誘導(dǎo)IFN-I生成,形成一個正反饋環(huán)路,最終促進(jìn)肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。6.Ifnar1-/-小鼠DEN誘癌后,20周時,敲除組肝中mi R-484并未高表達(dá),且其形成癌前病變明顯少于野生小鼠;40周時,其肝癌的大小和數(shù)量也顯著降低。7.在臨床肝臟組織和血液樣本中,mi R-484與IFN-I表達(dá)量相關(guān)。研究結(jié)論:本研究首次明確了肝臟的癌前病變HGDN中micro RNA的表達(dá)特征,發(fā)現(xiàn)了其中異常高表達(dá)的micro RNA。我們在動物水平和細(xì)胞水平證實(shí):肝臟的慢性炎癥或DNA損傷等誘導(dǎo)產(chǎn)生的低劑量I型干擾素,依賴于mi R-484啟動子區(qū)H3K27Ac的作用,選擇性誘導(dǎo)mi R-484生成;而異常高表達(dá)的mi R-484又能誘導(dǎo)IFN-I的生成,形成了一個正反饋環(huán)路,最終誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,促進(jìn)肝臟癌前病變的形成和腫瘤的發(fā)生。本研究首次發(fā)現(xiàn)低劑量的IFN-I具有促進(jìn)HGDN形成和肝癌發(fā)生的作用,相關(guān)結(jié)果為控制甚至逆轉(zhuǎn)肝臟的癌前病變HGDN提供了一些潛在的治療靶標(biāo)。第二部分CYP3A5在肝細(xì)胞癌中通過調(diào)控m TORC2/Akt信號通路發(fā)揮腫瘤抑制功能研究背景和目的:細(xì)胞色素P450家族通過對內(nèi)源性或外源性物質(zhì)的代謝在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用,其中CYP3A亞家族的作用尤為顯著。CYP3A亞家族含量最多、底物譜很大,是代謝反應(yīng)中最主要的限速酶之一。CYP3A亞家族包括4個主要成員,即CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43。由于CYP3A7主要存在于胎肝,而CYP3A43最近才被發(fā)現(xiàn),故這兩個成員的具體功能尚不明確;現(xiàn)今關(guān)于CYP3A亞家族研究最多的是它的兩個主要成員:CYP3A4和CYP3A5。其中,CYP3A4在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)功能已經(jīng)有較為充分的研究,它能活化前致癌物,且能參與抗腫瘤藥物的代謝;而CYP3A5是研究得最深入的CYP3A亞家族低豐度成員,但是相關(guān)研究仍主要集中于腫瘤發(fā)生和藥物代謝這兩個方面,且相關(guān)研究主要是一些流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果,對CYP3A5在腫瘤發(fā)展過程中的具體生物學(xué)功能則缺乏深入研究。研究方法:1.利用網(wǎng)絡(luò)基因芯片公共數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)CYP3A5在癌和癌旁的表達(dá)水平差異。2.運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色方法分析CYP3A5原位表達(dá)差異,并根據(jù)組織芯片組化染色結(jié)果進(jìn)行CYP3A5與臨床-病理特征的相關(guān)性分析。3.利用臨床肝癌標(biāo)本和不同轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞系分析CYP3A5在不同轉(zhuǎn)移能力肝癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)水平差異。4.肝癌細(xì)胞株過表達(dá)CYP3A5后進(jìn)行遷移、侵襲、粘附等轉(zhuǎn)移相關(guān)表型的體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。5.利用免疫印跡、si RNA、免疫共沉淀、酶譜分析、免疫組化染色等技術(shù),深入研究CYP3A5調(diào)控肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制。研究結(jié)果:1.CYP3A5的表達(dá)水平在肝細(xì)胞癌組織中顯著低于對應(yīng)癌旁組織。2.CYP3A5表達(dá)水平的高低與肝癌轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)性相關(guān),且與預(yù)后直接相關(guān)。3.體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)同時證明,過表達(dá)CYP3A5能明顯抑制肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲和粘附能力。4.CYP3A5通過抑制AKT信號通路活性,調(diào)節(jié)TIMP1、TIMP2的表達(dá)和MMP2、MMP9的活性。5.CYP3A5通過單純阻斷m TORC2激酶活性而非影響m TORC2復(fù)合物結(jié)構(gòu),選擇性下調(diào)AKT的磷酸化水平(Ser473)。6.CYP3A5通過誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)高水平的ROS抑制m TORC2的激酶活性,進(jìn)而抑制AKT(Ser473)活化,最終影響肝癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)表型。研究結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn),CYP3A5表達(dá)水平在肝細(xì)胞癌組織中較癌旁組織明顯下調(diào)。我們運(yùn)用大樣本的肝細(xì)胞癌組織芯片驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),這種表達(dá)差異與肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)臨床和病理指標(biāo)存在顯著相關(guān)性,即CYP3A5表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)性相關(guān)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明過表達(dá)CYP3A5可以顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲和粘附能力,且這種轉(zhuǎn)移相關(guān)表型的抑制作用主要是通過下調(diào)AKT信號通路活性,上調(diào)TIMP1、TIMP2表達(dá)水平和下調(diào)MMP2、MMP9的活性來實(shí)現(xiàn)的。通過深入的實(shí)驗(yàn)研究,我們發(fā)現(xiàn)CYP3A5介導(dǎo)的AKT(Ser473)活化減弱是m TORC2/p-AKT(S473)途徑依賴的。同時,我們首次報道了CYP3A5通過誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生高水平的ROS,從而在不影響m TORC2復(fù)合物穩(wěn)定性的情況下單純抑制m TORC2的激酶活性,最終抑制了p-AKT所介導(dǎo)的肝細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:In the first part , the research background and purpose of the pathogenesis of liver cancer in the first part : The World Health Organization ( WHO ) , in 1978 , clearly defined the precancerous lesion of liver cancer . The risk of malignant tumor of liver cancer was significantly higher than that of other non - malignant nodules , but not all precancerous lesions . The biological function of target micro RNA in malignant transformation of hepatocellular carcinoma was studied . In this study , it was found that the low dose of IFN - I could induce the formation of pre - cancerous lesions and the occurrence of liver cancer . In vitro and in vivo experiments prove that CYP3A5 can significantly inhibit the migration , invasion and adhesion of CYP3A5 in hepatocellular carcinoma .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：1519137