本文關(guān)鍵詞： HSP90 SIRT3 基因多態(tài)性 肝癌 細胞增殖 轉(zhuǎn)移 侵襲　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的本課題通過研究HSP90和SIRT3在肝癌細胞中的表達與侵襲以及兩者的多態(tài)性位點與肝癌發(fā)病風(fēng)險之間的相關(guān)性,旨在探討HSP90與SIRT3二者對肝癌發(fā)生發(fā)展的影響,并通過此項群體研究發(fā)現(xiàn)和鑒定新的肝細胞癌易感基因,試圖為肝癌易感人群的疾病預(yù)防提供新的標志物,同時也為開發(fā)和研制新的肝細胞癌臨床用藥提供新的靶標,以期對提高肝細胞癌的臨床防治效果提供幫助。方法(1)選取在2013年1月-2015年10月期間住院的198例肝癌患者,年齡在35-76歲范圍;同時采集198例體檢中心健康自愿者作為對照,年齡在33-69歲間。所有受試者均基于自愿并簽署知情同意書。對HSP90與SIRT3基因多態(tài)性與肝癌患病風(fēng)險進行相關(guān)性分析,此外還對具有飲酒史患者與肝癌易感性進行相關(guān)性分析。(2)將p GCSIL-GFP-HSP90重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染人肝癌AMMC-7721細胞,熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞中HSP90 m RNA的表達;MTT法檢測細胞生長情況;流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后對各組細胞凋亡的影響;Transwell小室法檢測細胞的侵襲能力;平板克隆形成實驗檢測細胞的增殖能力;細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移能力;Caspase-3活性檢測細胞的凋亡情況。(3)采用RNA干擾的方法沉默人肝癌細胞AMMC-7721中HSP90基因的表達獲得HSP90基因沉默細胞株si HSP90-AMMC-7721,分別將野生型WT-HSP90和突變型Mut-HSP90轉(zhuǎn)染si HSP90-AMMC-7721細胞;熒光定量PCR檢測各組細胞SIRT3 m RNA表達;western blot法檢測各組細胞SIRT3蛋白的表達。結(jié)果(1)HSP90 rs8005905與rs3742429基因多態(tài)性與肝癌的發(fā)生風(fēng)險之間存在顯著相關(guān)性;HSP90 rs3742429與具有飲酒史的人群的肝癌發(fā)生風(fēng)險呈顯著相關(guān)性。(2)上調(diào)AMMC-7721細胞中HSP90的表達后使細胞的增殖能力明顯增高;流式細胞儀檢測結(jié)果表明,上調(diào)細胞中HSP90的表達后對AMMC-7721細胞凋亡情況并未見顯著影響;通過Transwell小室法檢測結(jié)果表明上調(diào)HSP90的表達后視野平均侵襲細胞數(shù)量顯著增多;平板克隆形成實驗結(jié)果表明增高AMMC-7721細胞中HSP90的表達時,細胞克隆的形成能力明顯上升;細胞劃痕實驗檢測表明上調(diào)HSP90后AMMC-7721細胞的遷移性明顯增強;caspase-3活性檢測結(jié)果表明,上調(diào)HSP90表達后AMMC-7721細胞中caspase-3活性并未受到顯著影響。(3)用熒光定量PCR以及western blot法分別對轉(zhuǎn)染后各組細胞中SIRT3蛋白的表達情況進行檢測,結(jié)果表明野生型HSP90轉(zhuǎn)染后si HSP90-AMMC-772細胞中SIRT3m RNA和相應(yīng)蛋白的表達明顯降低;突變型HSP90轉(zhuǎn)染后si HSP90-AMMC-7721細胞中SIRT3 m RNA和相應(yīng)蛋白的表達無明顯變化。結(jié)論HSP90基因多態(tài)性以及患者是否有飲酒史與肝癌的發(fā)生之間存在密切聯(lián)系,且HSP90對肝癌細胞增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移過程的促進作用可能是通過抑制SIRT3的表達實現(xiàn)的。
[Abstract]:Objective to investigate the relationship between the expression and invasion of HSP90 and SIRT3 in HCC cells and the relationship between the polymorphic sites of HSP90 and SIRT3 and the risk of HCC in order to explore the effect of HSP90 and SIRT3 on the occurrence and development of HCC. Through this study, a new susceptibility gene of hepatocellular carcinoma was found and identified in order to provide a new marker for the prevention of HCC and a new target for the development and development of new clinical drugs for HCC. Methods A total of 198 patients with liver cancer, aged 35-76 years, were selected from January 2013 to October 2015, and 198 healthy volunteers were collected as control. All subjects were based on voluntary and signed informed consent letters. The association between polymorphism of HSP90 and SIRT3 gene and the risk of liver cancer was analyzed. In addition, the relationship between drinking history and susceptibility to liver cancer was analyzed. (2) the recombinant lentivirus vector of p GCSIL-GFP-HSP90 was transfected into human hepatoma AMMC-7721 cells, and the expression of HSP90 m RNA in transfected cells was detected by fluorescence quantitative PCR. The effect of transfection on cell apoptosis was detected by flow cytometry. RNA interference method was used to silence the expression of HSP90 gene in human hepatoma cell line AMMC-7721. The cell line si HSP90-AMMC-7721 was silenced by HSP90 gene. The wild type WT-HSP90 was isolated from the cell line si HSP90-AMMC-7721. And mutant Mut-HSP90 were transfected into si HSP90-AMMC-7721 cells. The expression of SIRT3 m RNA was detected by fluorescence quantitative PCR and the expression of SIRT3 protein was detected by western blot. Results there was a significant correlation between the polymorphism of HSP90 rs8005905 and rs3742429 gene and the risk of liver cancer. There was a significant correlation between HSP90 rs3742429 and people with drinking history. There was a significant correlation between the risk of HCC development and the proliferation of AMMC-7721 cells after upregulating the expression of HSP90. The results of flow cytometry showed that the up-regulation of HSP90 expression had no significant effect on the apoptosis of AMMC-7721 cells, and the results of Transwell chamber assay showed that the number of invading cells in the visual field was significantly increased after the expression of HSP90 was upregulated. The results of plate clone formation assay showed that the ability of cell clone formation was significantly increased when the expression of HSP90 was increased in AMMC-7721 cells, and the migration of AMMC-7721 cells after HSP 90 was significantly enhanced by cell scratch assay. The activity of caspase-3 in AMMC-7721 cells was not significantly affected by up-regulation of HSP90 expression. The expression of SIRT3 protein was detected by fluorescence quantitative PCR and western blot. The results showed that the expression of SIRT3m RNA and corresponding protein in si HSP90-AMMC-772 cells was significantly decreased after transfection of wild type HSP90. There was no significant change in the expression of SIRT3 m RNA and corresponding proteins in si HSP90-AMMC-7721 cells transfected with mutant HSP90. Conclusion there is a close relationship between the polymorphism of HSP90 gene and the history of drinking alcohol in patients with HCC, and the proliferation of HCC cells induced by HSP90. The promotion of invasion and metastasis may be achieved by inhibiting the expression of SIRT3.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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