本文關(guān)鍵詞： 小泛素樣蛋白 SUMO特異性半胱氨酸酶 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 前列腺癌細(xì)胞　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：小泛素樣蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能和定位中發(fā)揮重要作用。SUMO化修飾(SUMOylation)是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的共價(jià)修飾過程,可被SUMO特異性半胱氨酸酶(SUMO-specific cysteine proteases,SENPs)逆轉(zhuǎn)。SENPs在維持SUMO修飾的動(dòng)態(tài)平衡、保障細(xì)胞和機(jī)體正常生理功能中具有重要意義;而SENPs異常表達(dá)可破壞體內(nèi)的SUMO平衡,引起腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前已經(jīng)證實(shí),前列腺癌病人體內(nèi)SENP1表達(dá)上調(diào),而干涉SENP1可以抑制高轉(zhuǎn)移特性前列腺癌細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移,但其機(jī)制尚不明確。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factorβ,TGF?)是腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)的有效誘導(dǎo)劑;而EMT可促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。SMAD4作為重要的腫瘤抑制分子,是TGF-β/SMADs生長(zhǎng)抑制信號(hào)的關(guān)鍵分子;已有研究證實(shí),SMAD4失活與前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。SMAD4含有兩個(gè)SUMO位點(diǎn),SUMO修飾可以避免其被泛素化降解,從而增強(qiáng)胞內(nèi)SMAD4的表達(dá)水平和穩(wěn)定性。進(jìn)一步研究表明,SUMO修飾的SMAD4不但可以增強(qiáng)TGFβ/SMAD4介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性,還能負(fù)調(diào)控雄激素受體等轉(zhuǎn)錄因子。因此,SMAD4的SUMO修飾可能參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程。TGFβ/SMADs信號(hào)通路的關(guān)鍵分子SMAD4受到SUMO化修飾的調(diào)控,而TGF-β是EMT的有效誘導(dǎo)劑。因此,我們假設(shè)前列腺癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的SENP1可通過調(diào)控SMAD4的去SUMO化影響EMT,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。本課題旨在闡釋SENP1調(diào)控TGF-β/SMADs信號(hào)并影響前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)性能和EMT的作用與機(jī)制,探索前列腺癌治療的新靶點(diǎn)和新策略。首先,我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建了重組慢病毒載體PLKO.1-shSENP1,用于在高轉(zhuǎn)移特性的前列腺癌細(xì)胞中干涉SENP1的表達(dá);此外,我們構(gòu)建了重組腺病毒載體Ad-SENP1,用于在低轉(zhuǎn)移特性的前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)SENP1蛋白。具體為:(1)慢病毒載體構(gòu)建:(1)設(shè)計(jì)并合成SENP1的干涉序列(shSENP1)及對(duì)照序列(shScramble),將其構(gòu)建到PLKO.1載體上,獲得PLKO.1-shSENP1/shscramble,通過慢病毒包裝的三質(zhì)粒系統(tǒng)包裝,獲得重組慢病毒PLKO.1-sh SENP1/shscramble;(2)PEG沉淀法純化病毒,得到感染滴度分別為6.4×108TU/mL的PLKO.1-shSENP1,和6.8×108TU/mL的PLKO.1-shscramble;(2)腺病毒載體構(gòu)建:(1)將SENP1編碼序列構(gòu)建到穿梭質(zhì)粒pShuttle-cmv,得到穿梭質(zhì)粒pShuttle-cmv-SENP1;(2)采用Adeasy系統(tǒng),制備得到復(fù)制缺陷型腺病毒Ad-SENP1和對(duì)照病毒Ad-null;(3)氯化銫密度梯度離心法純化病毒,獲得高質(zhì)量的病毒產(chǎn)品,分別為:Ad-SENP1(2.5×1010IU/mL),Ad-null(2×1010IU/mL)。其次,采用20MOI慢病毒載體PLKO.1-shSENP1和對(duì)照病毒PLKO.1-sh Scramble感染具有高度轉(zhuǎn)移特性的激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞PC3M和PC3,檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移能力;檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子的表達(dá),包括E-cadherin、Vimentin等;檢測(cè)TGF-β/SMADs信號(hào)通路相關(guān)分子,如SMAD2/3及其磷酸化水平,SMAD4表達(dá)、受SMAD4調(diào)控的相關(guān)基因的表達(dá),如P53、P21WAF/Cip1、VEGF、HIF1?等。具體為:(1)PLKO.1-shSENP1感染PC3M細(xì)胞后,流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示SENP1干涉能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡(與PLKO.1-shscramble組相比,p0.01);劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SENP1干涉能有效抑制PC3M細(xì)胞的遷移能力(與PLKO.1-shscramble組相比,p0.01);(2)Western-blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,PLKO.1-shSENP1可下調(diào)Vimentin的表達(dá)(與PLKO.1-shscramble組相比,p0.01),并上調(diào)E-cadherin的表達(dá)(與PLKO.1-shscramble組相比,p0.01),提示SENP1干涉能夠抑制PC3M細(xì)胞的EMT;(3)同時(shí),western-blotting結(jié)果顯示,SENP1干涉能夠上調(diào)PC3M細(xì)胞中SMAD2/3和SMAD4蛋白表達(dá)水平;但是,real-time結(jié)果顯示,干涉SENP1能夠下調(diào)SMAD2/3和SMAD4的mRNA表達(dá)(與PLKO.1-shscramble組相比,p0.001);上述結(jié)果提示,SENP1可在轉(zhuǎn)錄后水平影響SMAD2/3和SMAD4的表達(dá)。(4)在PC3M細(xì)胞中,干涉SENP1能減少與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因,如VEGFA、HIF-1?在mRNA水平的表達(dá)(與PLKO.1-shscramble組相比,p0.001)。此外,在PC3細(xì)胞中,干涉SENP1也能有效抑制腫瘤細(xì)胞的EMT。再次,在具有低轉(zhuǎn)移活性的激素依賴性前列腺癌細(xì)胞LNCaP中,采用10MOI重組腺病毒載體Ad-SENP1和對(duì)照病毒Ad-Null感染細(xì)胞后,分別采用Western-blotting和real-time檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子、TGF-β/SMADs信號(hào)通路相關(guān)分子和受SMAD4調(diào)控的相關(guān)基因的表達(dá)水平。具體為:(1)Ad-SENP1感染LNCa P細(xì)胞后,western-blotting結(jié)果顯示,Ad-SENP1可介導(dǎo)SENP1在LNCaP細(xì)胞中高效表達(dá),同時(shí)下調(diào)SMAD2/3和SMAD4蛋白的表達(dá);然而,SENP1高表達(dá)可上調(diào)LNCaP細(xì)胞中SMAD2/3和SMAD4的mRNA表達(dá)水平(與Ad-null組相比,p0.001);(2)過表達(dá)SENP1能下調(diào)E-cadherin表達(dá),并上調(diào)Vimentin表達(dá),表明SENP1可促進(jìn)LNCaP細(xì)胞的EMT;(3)同時(shí),過表達(dá)SENP1還能上調(diào)HIF-1?并下調(diào)促凋亡基因的表達(dá)(與Ad-null組相比,p0.001)。上述結(jié)果提示,SENP1高表達(dá)可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的EMT和轉(zhuǎn)移。最后,我們構(gòu)建了SMAD4高表達(dá)載體和SUMO化位點(diǎn)突變載體,將其轉(zhuǎn)導(dǎo)SENP1高表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞,檢測(cè)SMAD4表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性,以及對(duì)細(xì)胞EMT的影響;同時(shí),采用SMAD4干涉載體轉(zhuǎn)導(dǎo)SENP1干涉的前列腺癌細(xì)胞,檢測(cè)SMAD4表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性,以及對(duì)細(xì)胞EMT的影響。(1)pcDNA3.0-SMAD4和pcDNA3.0-mutSMAD4的構(gòu)建:(1)合成SMAD4編碼框序列,并將其克隆到pcDNA3.0載體上,獲得pcDNA3.0-SMAD4;(2)設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)(K51R,K159R),采用重疊PCR擴(kuò)增,獲得具有突變位點(diǎn)的SMAD4序列,將其克隆到pcDNA3.0載體上,獲得pcDNA3.0-mutSMAD4。(2)SENP1對(duì)SMAD4去SUMO化的影響:將pcDNA3.0-SMAD4或pcDNA3.0-mut SMAD4轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞后24h,采用重組腺病毒Ad-SENP1或Ad-Null感染LNCaP細(xì)胞,Western-blotting檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,SENP1可以下調(diào)SMAD4的蛋白表達(dá),而突變的SMAD4能夠抑制SENP1對(duì)E-cadherin的下調(diào)作用,說明SENP1可能通過SMAD4調(diào)控E-cadherin的表達(dá)。(3)將特異針對(duì)SMAD4的干涉RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染PC3M細(xì)胞(SENP1干涉)后,western-blotting檢測(cè)SMAD4、E-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平。結(jié)果表明,干擾SMAD4能夠抑制SENP1干涉對(duì)E-cadherin、Vimentin的影響(與shRNA-NC組相比,p0.01)。上述結(jié)果表明,SENP1能夠通過調(diào)控SMAD4的SUMO修飾影響SMAD4的表達(dá)水平,進(jìn)一步調(diào)節(jié)E-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平,促進(jìn)腫瘤的EMT和轉(zhuǎn)移。綜上所述,我們以本實(shí)驗(yàn)室建立的重組慢病毒和腺病毒制備體系為平臺(tái),成功構(gòu)建并制備了干涉SENP1表達(dá)的慢病毒載體PLKO.1-shSENP1和高表達(dá)SENP1的腺病毒載體Ad-SENP1。在具有高度轉(zhuǎn)移特性的前列腺癌細(xì)胞中,干涉SENP1能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、激活TGF-β/SMADs信號(hào)通路,抑制腫瘤細(xì)胞的EMT;而SMAD4干涉,能夠消除SENP1對(duì)EMT相關(guān)分子的影響,表明SENP1通過SMAD4抑制腫瘤細(xì)胞的EMT。而在具有低轉(zhuǎn)移特性的前列腺癌細(xì)胞中,高表達(dá)SENP1能夠下調(diào)SMAD4的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT;而SUMO修飾位點(diǎn)突變的SMAD4,能夠抑制SENP1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞EMT,表明SENP1通過對(duì)SMAD4的去SUMO修飾促進(jìn)EMT的發(fā)生。上述研究結(jié)果表明,SENP1是晚期高轉(zhuǎn)移性前列腺癌的潛在治療靶點(diǎn),本研究為進(jìn)一步探討前列腺癌新的治療策略提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.25

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本文編號(hào)：1512151