本文關(guān)鍵詞： CD40基因 大腸癌 共刺激分子 減毒沙門氏菌 基因疫苗　出處：《蘇州大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分:重組大鼠CD40基因真核表達載體的構(gòu)建及功能鑒定目的:構(gòu)建含pIRES2-EGFP-CD40基因的真核表達質(zhì)粒。方法:從大鼠的脾臟組織中完整克隆出大鼠CD40基因全長,成功構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD40,通過脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染COS7細胞,免疫雙熒光法檢測CD40的表達。結(jié)果:成功構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD40并轉(zhuǎn)染COS7細胞,證明真核表達質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD40在COS7細胞中能夠穩(wěn)定表達目的基因。結(jié)論:成功構(gòu)建了含pIRES2-EGFP-CD40基因的真核表達質(zhì)粒。第二部分:含pIRES2-EGFP-CD40質(zhì)粒減毒沙門氏菌的構(gòu)建及功能鑒定目的:構(gòu)建含pIRES2-EGFP-CD40質(zhì)粒的減毒沙門氏菌菌疫苗。方法:采用電轉(zhuǎn)化法將pIRES2-EGFP-CD40質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入鼠傷寒沙門氏菌(LB5000),經(jīng)過甲基化修飾后的pIRES2-EGFP-CD40質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入終宿主菌SL3261,通過抗生素篩選法挑取單個菌落進行擴增,最終抽提質(zhì)粒并進行PCR鑒定。結(jié)果:終宿主菌SL3261在電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入pIRES2-EGFP-CD40質(zhì)粒后,通過質(zhì)粒抽提和PCR鑒定證實,其所獲得的目的條帶與原轉(zhuǎn)化質(zhì)粒條帶大小相同。結(jié)論:成功構(gòu)建了能攜帶大鼠CD40基因真核表達質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD40的SL3261疫苗菌。第三部分:含pIRES2-EGFP-CD40質(zhì)粒減毒沙門氏菌對大鼠大腸癌生長的影響目的:探討減毒沙門氏菌為載體的CD40基因疫苗對荷瘤大鼠免疫系統(tǒng)的影響及治療大腸癌可行性。方法:雄性6-8周齡SD大鼠18只隨機分為3組,分別為SL3261組、空質(zhì)粒(pIRES2-EGFP)組以及CD40(pIRES2-EGFP-CD40)組。對全部大鼠應用1,2-二甲肼連續(xù)皮下注射18周以構(gòu)建大鼠大腸癌實驗模型,分別于第8周、第10周、第12周及第16周根據(jù)所分組別不同共四次灌服SL3261、pIRES2-EGFP/SL3261和pIRES2-EGFP-CD40/SL3261,于18周后處死全部實驗大鼠,將大鼠瘤體解剖后觀察并記錄瘤體大小、瘤體數(shù)量、有無轉(zhuǎn)移灶等,根據(jù)觀察指標進行Dukes分期;流式細胞儀檢測外周血和脾臟細胞表型,PHA刺激脾臟細胞72小時后培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量通過ELISA法檢測,脾臟細胞中GFP的轉(zhuǎn)錄表達通過RT-PCR進行檢測。結(jié)果:CD40組平均成瘤數(shù)為5.8±2.2個,明顯低于SL3261組的12.7±3.1和空質(zhì)粒組的11.6±2.4(P0.05),空質(zhì)粒組和SL3261組兩組的成瘤數(shù)相比較無明顯統(tǒng)計學意義(P0.05);脾臟細胞和外周血表型檢測顯示CD40組的活化T細胞CD3+CD8+數(shù)量較其它荷瘤組明顯增高(P0.05),PHA刺激脾細胞試驗結(jié)果證實空質(zhì)粒組和SL3261組分泌IFN-γ的能力也明顯低于CD40組(P0.05)。結(jié)論:攜帶重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD40的減毒沙門氏菌可以在荷瘤大鼠體內(nèi)實現(xiàn)轉(zhuǎn)染CD40基因并有效高表達,能顯著提高荷瘤大鼠的細胞免疫功能,最終對實驗性大鼠大腸癌具有明顯的抑制作用。
[Abstract]:Part one: construction and functional Identification of Recombinant Rat CD40 Gene Eukaryotic expression Vector objective: to construct an eukaryotic expression plasmid containing pIRES2-EGFP-CD40 gene. Methods: the whole length of rat CD40 gene was cloned from rat spleen tissue. The eukaryotic expression plasmid pIRES2-EGFP-CD40 was successfully constructed and transfected into COS7 cells by liposome. The expression of CD40 was detected by double immunofluorescence assay. Results: the eukaryotic expression plasmid pIRES2-EGFP-CD40 was successfully constructed and transfected into COS7 cells. It is proved that the eukaryotic expression plasmid pIRES2-EGFP-CD40 can stably express the target gene in COS7 cells. Conclusion: the eukaryotic expression plasmid containing pIRES2-EGFP-CD40 gene was successfully constructed. Part 2: construction and functional identification of attenuated Salmonella mutans containing pIRES2-EGFP-CD40 plasmid. A attenuated Salmonella vaccine containing pIRES2-EGFP-CD40 plasmids was constructed. Methods: the pIRES2-EGFP-CD40 plasmid was successfully transferred to LB5000 of Salmonella typhimurium by electroporation. The methylated pIRES2-EGFP-CD40 plasmid was transformed into the terminal host strain SL3261 by electrotransformation. A single colony was selected for amplification by biotin screening method. The final plasmid was extracted and identified by PCR. Results: the final host strain SL3261 was transformed into pIRES2-EGFP-CD40 plasmid and confirmed by plasmid extraction and PCR identification. The obtained target bands were the same as the original transformed plasmid bands. Conclusion: the SL3261 vaccine bacteria carrying rat CD40 gene eukaryotic expression plasmid pIRES2-EGFP-CD40 were successfully constructed. Part 3: Salmonella mutans containing pIRES2-EGFP-CD40 plasmids were used to reduce the toxicity of Salmonella to rats. Objective: to investigate the effect of attenuated Salmonella CD40 gene vaccine on immune system of tumor-bearing rats and the feasibility of treating colorectal cancer. Methods: eighteen male SD rats aged 6-8 weeks were randomly divided into 3 groups. SL3261 group, pIRES2-EGFP group and CD40 pIRES2-EGFP-CD40 group were injected subcutaneously for 18 weeks to establish the experimental model of colorectal cancer in rats. At week 12 and week 16, SL3261pIRES2-EGFP / SL3261 and pIRES2-EGFP-CD40 / SL3261 were administered four times according to different groups. After 18 weeks, all the experimental rats were killed. The tumor size, the number of tumor, the number of tumor and the metastasis were observed and recorded. The content of IFN- 緯 in the culture supernatant of peripheral blood and spleen cells stimulated by phenotype of peripheral blood and spleen cells for 72 hours was detected by ELISA method. The expression of GFP in spleen cells was detected by RT-PCR. Results the average number of tumorigenesis was 5.8 鹵2.2 in the CD 40 group. It was significantly lower than that in SL3261 group (12.7 鹵3.1) and empty plasmid group (11.6 鹵2.4 P0.05). There was no significant difference in the number of tumorigenesis between empty plasmid group and SL3261 group, and the phenotypic tests of spleen cells and peripheral blood showed that the number of CD3 CD8 in activated T cells in CD40 group was higher than that in other groups. The results of splenocyte stimulation test showed that the ability of secreting IFN- 緯 in empty plasmid group and SL3261 group was significantly lower than that in CD40 group. Conclusion: attenuated Salmonella mutans carrying recombinant plasmid pIRES2-EGFP-CD40 can transfect CD40 in tumor-bearing rats. The gene is effectively overexpressed, It can significantly improve the cellular immune function of tumor-bearing rats, and finally has a significant inhibitory effect on experimental colorectal cancer in rats.
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34

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本文編號：1512355