發(fā)布時間：2018-02-14 09:37

  本文關(guān)鍵詞： 肝癌 外泌體 腫瘤的起源 腫瘤干細(xì)胞 腫瘤轉(zhuǎn)移 單細(xì)胞測序 突變　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和目的肝癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率都在不斷增加的幾種少數(shù)實體瘤之一,是腫瘤相關(guān)疾病導(dǎo)致死亡的第二大惡性腫瘤。肝細(xì)胞型肝癌是原發(fā)性肝癌的主要類型,其具有很強(qiáng)的表型和分子異質(zhì)性。肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及微衛(wèi)星病灶的形成是肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要形式,肝內(nèi)血竇、小膽管分布密集為肝癌的肝內(nèi)播散提供了有利條件。作為機(jī)體最大的消化器官和代謝器官,肝臟具有強(qiáng)大的再生功能,已經(jīng)明確證實的肝內(nèi)干細(xì)胞、星狀細(xì)胞、成熟的肝細(xì)胞以及外源性的間充質(zhì)干細(xì)胞都可參與肝臟的損傷修復(fù),協(xié)同肝組織的再生,理論上每一群可再生的細(xì)胞都有可能在損傷修復(fù)的過程中發(fā)生錯配,形成肝癌的最初起源,這造成了肝癌起源的多重可能。起源的復(fù)雜性進(jìn)一步導(dǎo)致了肝癌內(nèi)部的異質(zhì)性,具有異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞之間以及腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的信號傳導(dǎo)錯綜復(fù)雜,在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中相互依賴相互促進(jìn),對肝癌的臨床治療形成了嚴(yán)峻的考驗�；旌闲透伟┳鳛楦伟┑囊环N特有類型,以發(fā)病人群低、腫瘤惡性度高、成分構(gòu)成復(fù)雜為其主要特征,受限于現(xiàn)有的臨床診斷的方式與病理學(xué)診斷指標(biāo),對這種類型肝癌的臨床診療就變得更加困難�；诟伟┑难芯楷F(xiàn)狀,本課題希望從以下幾個方面尋求肝癌研究領(lǐng)域的突破,旨在通過臨床-基礎(chǔ)-臨床間的相互轉(zhuǎn)化,為肝癌的臨床診療提供新的思路:借助對腫瘤細(xì)胞間物質(zhì)及信號傳遞的重要介質(zhì)——外泌體的相關(guān)研究,揭示肝癌內(nèi)部不同腫瘤細(xì)胞之間交互作用的新機(jī)制;利用基因組及外顯子測序分析在單細(xì)胞水平對肝癌的起源進(jìn)行探究,確定腫瘤干細(xì)胞在肝癌發(fā)生發(fā)展及腫瘤復(fù)發(fā)過程中的作用;希望通過基因組學(xué)的相關(guān)研究尋找到輔助肝癌臨床評估的新指標(biāo);通過基因組和外顯子組的數(shù)據(jù)分析希望可以在一定程度上對肝癌的臨床亞型——混合型肝癌的高頻突變基因及特異性驅(qū)動基因進(jìn)行揭示,為臨床診療提供潛在的診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。研究方法和結(jié)果研究方法1.超速離心法制備純化腫瘤細(xì)胞外泌體,并通過電鏡掃描、外泌體染色、蛋白定量分析及mi RNA定量分析,對肝癌細(xì)胞外泌體進(jìn)行多重表征。2.通過肝癌細(xì)胞外泌體與正常肝細(xì)胞共培養(yǎng),利用RT-PCR對調(diào)控DNA損傷修復(fù)的84個關(guān)鍵酶活性進(jìn)行檢測,明確肝癌細(xì)胞外泌體對正常受體細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的調(diào)控作用。3.利用劃痕實驗、趨化實驗、侵襲實驗及克隆形成實驗探究肝癌細(xì)胞相關(guān)外泌體對腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用。4.構(gòu)建經(jīng)放療致死劑量照射后進(jìn)行異體骨髓移植的小鼠模型,并在建立此模型的基礎(chǔ)上誘導(dǎo)小鼠原發(fā)肝癌的產(chǎn)生,探究肝癌的起源。5.利用流式分選技術(shù)對新鮮肝癌組織樣本中的腫瘤干細(xì)胞及非干腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分離,體外驗證干細(xì)胞生物學(xué)特征的同時利用單細(xì)胞全基因組測序技術(shù)分析腫瘤干細(xì)胞及非干腫瘤細(xì)胞的基因拷貝變異,繪制腫瘤進(jìn)化模型,探討肝癌干細(xì)胞在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。6.通過對比不同臨床特點(diǎn)肝癌患者(初發(fā)肝癌和復(fù)發(fā)肝癌)的腫瘤進(jìn)化模型,探究腫瘤干細(xì)胞在腫瘤復(fù)發(fā)過程中的作用;通過對比不同惡性程度肝癌患者(有血管侵犯和無血管侵犯)的基因拷貝變異程度的差異,探討肝癌基因拷貝變異程度對肝癌惡性程度的評價作用。7.通過對混合型肝癌臨床新鮮冰凍樣本的全基因組和外顯子測序,分析其拷貝數(shù)變異及單核苷酸變異,進(jìn)而探究混合型肝癌的高頻突變基因及特異性突變基因,輔助混合型肝癌的臨床診斷及治療。8.通過單細(xì)胞全基因組測序分析及單細(xì)胞突變驗證,揭示混合型肝癌的腫瘤異質(zhì)性,探究其可能存在的克隆起源。結(jié)果1.Rab27a可以調(diào)控肝癌細(xì)胞外泌體的分泌,其表達(dá)強(qiáng)度與肝癌患者的肝硬化程度、血清AFP水平以及血管侵犯呈正相關(guān)。2.肝癌細(xì)胞相關(guān)外泌體可以影響正常肝細(xì)胞的DNA損傷修復(fù),使得正常肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。3.肝癌細(xì)胞分泌的外泌體可以促進(jìn)受體腫瘤細(xì)胞的體外運(yùn)動、趨化、侵襲以及克隆形成能力;體內(nèi)研究結(jié)果證實肝癌細(xì)胞相關(guān)外泌體可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的肝內(nèi)播散和肝外轉(zhuǎn)移,與肝癌的術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)。4.經(jīng)放療致死劑量照射并進(jìn)行異體骨髓移植的小鼠原發(fā)肝癌模型揭示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與肝臟損傷后的修復(fù),并作為肝癌重要的克隆起源參與肝癌的發(fā)生與發(fā)展。5.單細(xì)胞全基因組基因拷貝變異分析結(jié)果揭示肝癌干細(xì)胞貫穿肝癌發(fā)生發(fā)展的始終并與肝癌的術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)。6.肝癌組織內(nèi)部存在一定的異質(zhì)性,從單細(xì)胞水平揭示肝癌的基因拷貝變異的復(fù)雜性可能有助于判斷肝癌的惡性程度。7.TP53在混合型肝癌患者中的突變頻率顯著高于肝細(xì)胞肝癌和膽管細(xì)胞型肝癌,可作為輔助混合型肝癌診斷的潛在指標(biāo)之一。8.混合型肝癌存在特有的高頻突變基因,包括FSIP2,PKHD1L1,SVEP1,LRP1B,這是在以往肝癌測序相關(guān)研究中從未被報道的,對這些高頻基因進(jìn)行深入的揭示可能有助于了解混合型肝癌的發(fā)生并可作為潛在的臨床診斷指標(biāo)或治療靶點(diǎn)。9.單細(xì)胞水平對混合型肝癌進(jìn)行全基因組拷貝數(shù)變異分析及單核苷酸變異驗證揭示了混合型肝癌內(nèi)部的異質(zhì)性以及具有肝細(xì)胞表型的腫瘤細(xì)胞和具有膽管細(xì)胞表型的腫瘤細(xì)胞具有相同的起源。結(jié)論1.Rab27a可作為預(yù)測肝癌患者肝硬化程度及血管侵犯的潛在指標(biāo);肝癌細(xì)胞分泌的外泌體被受體細(xì)胞攝取后一方面會促進(jìn)其發(fā)生EMT,進(jìn)而增強(qiáng)其遷移、侵襲的能力,另一方面會影響受體細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)進(jìn)程,進(jìn)而促進(jìn)正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化;體內(nèi)實驗結(jié)果表明肝癌細(xì)胞分泌的外泌體還可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及肝外播散。2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在肝臟損傷的情況下會進(jìn)入肝臟參與肝修復(fù)和再生,并在一定環(huán)境下可作為肝癌的起源參與肝癌發(fā)生發(fā)展的全程;抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與肝臟的損傷修復(fù)在一定程度上有助于降低肝癌的發(fā)病率(基于本研究所建立的小鼠模型所得到的結(jié)論)。3.肝癌干細(xì)胞參與肝癌發(fā)生發(fā)展的全過程并在肝癌復(fù)發(fā)的過程中起到重要作用;肝癌內(nèi)部存在一定的異質(zhì)性,不同的干細(xì)胞亞群可能存在不同的調(diào)控功能;肝癌細(xì)胞拷貝數(shù)變異的復(fù)雜程度可作為預(yù)測肝癌惡性程度的潛在指標(biāo)。4.混合型肝癌較肝細(xì)胞肝癌和膽管細(xì)胞型肝癌具有更高的TP53突變頻率;混合型肝癌具有不同于其余兩種肝癌亞型的特異性突變基因:FSIP2,PKHD1L1,SVEP1,LRP1B;混合型肝癌中向肝細(xì)胞分化和向膽管細(xì)胞分化的腫瘤細(xì)胞具有相同的起源,而不是在發(fā)育成熟以后各自發(fā)生致癌轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的。
[Abstract]:Liver cancer is the main type of liver cancer , and it has a strong regeneration function . It has been proved that the liver stem cells , stellate cells , mature hepatocytes and exogenous mesenchymal stem cells can be involved in the development of liver cancer . Objective To investigate the role of hepatocellular carcinoma ( HCC ) in hepatocellular carcinoma ( HCC ) .

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7
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本文編號：1510404