本文關(guān)鍵詞： 乳腺癌 干擾素誘導跨膜蛋白3 RNAi 增殖能力　出處：《吉林大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：隨著早期預防、早期診斷及靶向治療的不斷發(fā)展,乳腺癌的發(fā)病率已經(jīng)逐漸下降而且生存率在逐步提升,但乳腺癌仍是世界范圍內(nèi)重大健康問題,是女性最常見的腫瘤。乳腺癌的發(fā)生、復發(fā)及對治療的耐受機制等諸多問題仍有待于進一步闡明。干擾素誘導跨膜蛋白(IFITM)是1984年首先由Friedman等發(fā)現(xiàn),屬于小分子干擾素誘導基因(ISGs)家族成員。迄今,在人體內(nèi)IFITMs有5個家族成員,分別為IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM10,均位于11(11p15.5)號染色體上。該基因家族主要編碼125-133個氨基酸,其中包括2個跨膜區(qū)域。IFITM5主要參與骨特異性礦物化調(diào)節(jié),IFITM10目前所知不多。干擾素誘導跨膜蛋白1、2、3是重要的抗病毒蛋白,可以抑制多種入侵的致病病毒,如HIV病毒、流感病毒、水泡性口炎病毒等。同時,某些種屬的IFITMs蛋白涉及多個細胞代謝過程,包括免疫細胞的調(diào)節(jié)、體節(jié)發(fā)生、生殖細胞的歸巢和成熟、細胞增殖和心肌細胞的發(fā)育。然而,最近研究發(fā)現(xiàn)IFITMs在腫瘤發(fā)展中也扮演了重要角色,而不同腫瘤類型內(nèi)IFITM表達水平可表現(xiàn)為顯著上調(diào)或下調(diào)。IFITMs在結(jié)腸癌組織中高表達,同時胃癌細胞系也伴有IFITM1蛋白的高表達。而在人類黑素瘤細胞系基因表達的篩選中,某些細胞系內(nèi)IFITM表達卻下降。Wang等證實IFITM2蛋白在HER-2過表達的鼠乳腺癌中顯著升高,Abba MC等在乳腺癌基因表達分析中發(fā)現(xiàn)浸潤性乳腺癌比導管內(nèi)原位癌中的IFITM3基因表達亦升高。雖然IFITM3在腫瘤的研究近年得到人們的關(guān)注,但是IFITM3在乳腺癌中的表達、相關(guān)作用及相關(guān)機理仍沒有闡明。本研究以IFITM3為研究靶點,檢測乳腺癌根治術(shù)切除標本中IFITM3蛋白的表達,同時以配對癌旁乳腺組織為對照,分析乳腺癌IFITM3表達與乳腺癌發(fā)生、預后密切相關(guān)蛋白(即ERα、PR和HER-2等)在乳腺癌組織中的相關(guān)性,及分析乳腺癌IFITM3表達與乳腺癌患者各臨床特點可能的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上,利用慢病毒介導的sh RNA,沉默乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231內(nèi)源IFITM3表達,觀察其對乳腺癌細胞株細胞增殖能力等改變,并探索其相關(guān)作用機制。方法:1、乳腺癌組織中IFITM3的表達:收集81例乳腺癌根治術(shù)病例,免疫組織化學染色方法檢測乳腺癌中IFITM3的表達,分析乳腺癌中IFITM3表達及其臨床病理意義;2、沉默乳腺癌細胞系內(nèi)源性IFITM3基因:利用Real-time PCR對5株體外培養(yǎng)的乳腺癌細胞中IFITM3的表達進行檢測,篩選相對高表達IFITM3的乳腺癌細胞株后,利用慢病毒介導的RNAi,抑制乳腺癌細胞系內(nèi)源性IFITM3表達,并以Real-time PCR和Western Blot方法分別在m RNA和蛋白水平上鑒定IFITM3基因的沉默效率;3、沉默IFITM3基因后對乳腺癌細胞增殖的改變:利用MTT法、Brdu摻入實驗、流式細胞術(shù)、平板克隆形成實驗研究下調(diào)IFITM3表達對乳腺癌細胞增殖的影響;并利用Western Blot檢測下調(diào)IFITM3表達后細胞周期相關(guān)蛋白表達改變;4、沉默IFITM3基因后對乳腺癌細胞遷徙及侵襲能力的改變:利用細胞劃痕實驗及Transwell侵襲實驗研究下調(diào)IFITM3表達對乳腺癌細胞的影響;并利用Western Blot檢測下調(diào)IFITM3表達后MMP-9蛋白表達變化;5、雌激素及雌激素受體拮抗劑對乳腺癌MCF-7細胞IFITM3的影響:溶劑對照、1n M 17β-雌二醇(E2)、1μM 4-羥基三苯氧胺(4-hydroxytamoxifen,4-OHT)及1μM氟維司瓊(Fulvestrant,ICI 182780)孵育雌激素依賴型乳腺癌細胞系MCF-724小時后,Real-time PCR檢測IFITM3 m RNA的變化。結(jié)果:1、收集的81例乳腺癌組織中包含導管內(nèi)原位癌(DCIS)32例,浸潤性導管癌(IDC)49例,以及配對癌旁乳腺組織為對照,免疫組化結(jié)果顯示IFITM3表達于細胞漿內(nèi)。在32例DCIS組中,9例(28.12%)癌組織內(nèi)IFITM3表達強陽性,13例(40.63%)為陰性;其配對癌旁乳腺組織僅有3例IFITM3(9.38%)表達強陽性,陰性表達為21例(65.62%);原位癌組織內(nèi)IFITM3的強陽性表達與其ERα、PR、HER-2的表達以及患者的年齡未見有明確的相關(guān)性。而49例IDC組中,29例(59.18%)癌組織內(nèi)IFITM3表達強陽性,5例(10.20%)陰性,其配對癌旁乳腺組織僅有4例(8.16%)IFITM3表達為強陽性,28例(57.14%)為陰性;IDC組織內(nèi)IFITM3的強陽性表達與癌組織ERα、PR的表達呈現(xiàn)顯著相關(guān)性,而與癌組織中HER-2、Ki67、P53、EGFR、CK14的表達未見相關(guān)性;同時癌組織內(nèi)IFITM3的過表達與患者的年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤的組織學分級未見相關(guān)性。2、Real-time PCR方法檢測5種乳腺癌細胞內(nèi)源性IFITM3 m RNA表達,結(jié)果顯示:乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231內(nèi)有相對高的IFITM3 m RNA表達。利用含有IFITM3 sh RNA的重組慢病毒成功沉默了乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231中IFITM3的表達。3、MTT細胞生長曲線結(jié)果顯示,沉默IFITM3第5天,與對照組相比si-IFITM3組OD490nm值顯著下降,MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖受到抑制;Brd U摻入實驗結(jié)果顯示,Brd U摻入72h時后,與對照組相比si-IFITM3組MCF-7和MDA-MB-231細胞系的OD490nm吸光率下降;流式細胞儀檢測細胞周期顯示:si-IFITM3組與其相應的對照組細胞相比,MCF-7和MDA-MB-231細胞處于相對靜止G0/G1期的細胞百分比增加,處于DNA合成的S期的細胞減少;克隆形成實驗顯示,si-IFITM3組與相應的對照組相比,MCF-7和MDA-MB-231細胞系克隆形成能力下降;沉默IFITM3基因后下調(diào)MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞Cyclin D1、CDK4表達,上調(diào)CDKN1A(P21)表達;4、同時,IFITM3表達下調(diào)后乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231與其相應的對照組相比細胞遷移速度降低,細胞穿過Matrigel膠的侵襲能力降低;沉默IFITM3基因后MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞MMP-9表達下調(diào);5、17β-雌二醇(E2)和4-羥基三苯氧胺(4-OHT)加藥組比溶劑對照組乳腺癌MCF-7細胞的IFITM3 m RNA表達顯著升高;而氟維司瓊(ICI 182780)加藥組比溶劑對照組乳腺癌MCF-7細胞的IFITM3 m RNA表達下降。結(jié)論:1、人乳腺癌組織內(nèi)IFITM3的強陽性表達率顯著高于配對癌旁乳腺組織。乳腺浸潤性導管癌中,癌組織內(nèi)IFITM3的強陽性表達與癌組織中ERα、PR表達呈明顯正相關(guān)性。2、體外沉默IFITM3后,明顯降低了乳腺癌細胞株體外細胞增殖能力,使乳腺癌細胞阻滯在G0/G1期,降低Cyclin D1、CDK4蛋白,上調(diào)P21蛋白表達。3、體外沉默IFITM3后,明顯降低了乳腺癌細胞體外細胞遷移及侵襲能力,下調(diào)MMP-9蛋白表達。4、雌激素及雌激素受體拮抗劑顯著影響ERα陽性乳腺癌細胞MCF-7內(nèi)IFITM3表達。這些結(jié)果提示IFITM3在乳腺癌細胞增殖、侵襲中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能,IFITM3表達與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切的相關(guān)性。
[Abstract]:The expression of IFITM3 and IFITM3 in breast cancer have been significantly increased or down - regulated . The effects of IFITM3 on proliferation of breast cancer cells were studied by MTT assay , Brdu incorporation assay , flow cytometry and plate cloning . Results : 1 . The expression of IFITM3 in breast cancer cells was regulated by Western Blot . The expression of IFITM3 mRNA in MCF - 7 and MDA - MB - 231 cells in breast cancer cell line MCF - 7 and MDA - MB - 231 was significantly decreased compared with control group . In vitro silencing IFITM3 , the expression of IFITM3 in breast cancer cell line MCF - 7 was significantly decreased and the expression of MMP - 9 protein was downregulated . The results suggested that IFITM3 plays an important role in regulating the proliferation and invasion of breast cancer cells .

【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：1510316