本文關(guān)鍵詞： 鼻咽癌 STING 髓源性抑制細(xì)胞 miR-24 預(yù)后　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一種高發(fā)于我國(guó)華南地區(qū)的惡性腫瘤,95%以上的NPC與EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染密切相關(guān)。放化療為基礎(chǔ)的綜合治療是目前主流的治療方式,但局部進(jìn)展的NPC 5年復(fù)發(fā)率在40%以上,復(fù)發(fā)難治、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NPC中位總生存時(shí)間不足1年。腫瘤免疫治療,因其低毒性和潛在的治愈性,成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。PD-1抗體、過(guò)繼性T細(xì)胞回輸?shù)让庖咧委?已在NPC顯示出初步的療效。然而,已有的免疫治療有效率偏低：腫瘤微環(huán)境中的抑制性細(xì)胞、負(fù)向調(diào)控分子,是腫瘤免疫逃逸及免疫治療失敗的重要原因。髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-deprived suppressor cells, MDSC),是一種具有抑制功能的未成熟髓系細(xì)胞。MDSC在NPC大量擴(kuò)增、活化,抑制了殺傷性T細(xì)胞的功能,促進(jìn)了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。STING信號(hào)通路,是免疫系統(tǒng)識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中異常來(lái)源的雙鏈DNA,發(fā)揮天然免疫的重要通路：皰疹病毒、結(jié)核分枝桿菌等病原體的DNA,進(jìn)入樹(shù)突細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),該通路被激活,樹(shù)突細(xì)胞合成大量的Ⅰ型干擾素,促進(jìn)抗原呈遞、啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。近兩年的研究表明：來(lái)源于腫瘤的DNA,也可以激活STING信號(hào)通路,啟動(dòng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康难芯縎TING信號(hào)通路在NPC的活化狀態(tài),探索該通路與MDSC分化的關(guān)系及臨床意義。實(shí)驗(yàn)材料和方法1.檢測(cè)STING信號(hào)通路的活化狀態(tài)：利用免疫組化、ELSI A (the enzyme-linked immunosorbent assay)、Western blot等,檢測(cè)臨床樣本(腫瘤及癌旁組織、患者及健康人血清)和細(xì)胞系(癌細(xì)胞系、正常鼻咽上皮細(xì)胞系)中STING的表達(dá)、信號(hào)通路的活性。2.分析STING信號(hào)通路影響MDSC的分化：利用過(guò)表達(dá)、siRNA沉默、磷酸化位點(diǎn)突變等技術(shù)手段以及癌細(xì)胞和CD33+細(xì)胞共培養(yǎng)體系,流式檢測(cè)分析STING信號(hào)通路對(duì)MDSC分化的影響。收集共培養(yǎng)體系上清,ELISA測(cè)定IL-6、GM-CSF、IL-1β等細(xì)胞因子。3.篩查調(diào)控STING的miRNA:結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè),利用qPCR、Western Blot及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),篩查并驗(yàn)證NPC中調(diào)控STING的miRNA.4.研究STING信號(hào)通路的臨床意義：收集臨床資料,統(tǒng)計(jì)分析STING信號(hào)通路與MDSC水平、EB病毒DNA載量、分期、預(yù)后等臨床指標(biāo)的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. STING信號(hào)通路在NPC中下調(diào)：癌組織中的STING表達(dá)量顯著地低于配對(duì)的癌旁組織(n=22,p0.001),患者血清中的STING濃度顯著地低于健康人(p=0.025)。癌細(xì)胞系(TW03、CNE2)中STING的表達(dá)量,低于正常鼻咽上皮細(xì)胞系(NP69); HSV-1刺激后,TW03、CNE2中p-TBK1、p-IRF3水平及IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平,低于NP69。2. STING信號(hào)通路的下調(diào)促進(jìn)了MDSC的分化：相比于對(duì)照組,過(guò)表達(dá)STING的TW03,誘導(dǎo)產(chǎn)生的MDSC數(shù)目明顯減少(p0.05),對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制能力明顯減弱(p0.05)；利用siRNA技術(shù)敲低TW03中的STING或?qū)TING磷酸化位點(diǎn)突變,誘導(dǎo)MDSC的結(jié)果正好相反。患者腫瘤組織中,STING與CD33的表達(dá)量,呈顯著的負(fù)相關(guān)(n=50,p0.001).3.miR-24調(diào)控STING的表達(dá)：生物信息學(xué)預(yù)測(cè),STING是miR-24的直接作用靶點(diǎn)；TW03、CNE2細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)miR-24,可下調(diào)STING mRNA的轉(zhuǎn)錄及STING蛋白的表達(dá)；熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí),miR-24可直接結(jié)合STING 3'UTR。4.腫瘤組織中STING表達(dá)的臨床意義：患者腫瘤組織中STING的表達(dá)量,與血清中STING的濃度線性相關(guān)(n=50,r=0.5928,P0.0001),與基線EB病毒DNA載量負(fù)相關(guān)(n=50,P=0.041),與接受同步放療后的無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間正相關(guān)(n=89,p=0.041)。結(jié)論：STING信號(hào)通路在鼻咽癌中下調(diào),促進(jìn)了MDSC的分化,增強(qiáng)了MDSC的免疫抑制功能,是患者預(yù)后不良的因素之一。此外,miR-24在鼻咽癌中過(guò)表達(dá),可能是STING表達(dá)下降的原因之一。
[Abstract]:The background of nasopharyngeal carcinoma (Nasopharyngeal carcinoma NPC) is in China's Southern China region has a high incidence of malignant tumors, NPC and EB more than 95% viruses (Epstein-Barr virus, EBV) infection is closely related. Comprehensive treatment based chemoradiotherapy is the main treatment method, but the Bureau of the Ministry of the progression of NPC 5 year recurrence rate in 40% above, relapsed, distant metastasis NPC median overall survival time of less than 1 years. Tumor immunotherapy, due to its low toxicity and potential cure, become the focus of current research of.PD-1 antibody, adoptive T cell transfusion immune therapy, has been in the NPC show preliminary curative effect. However, immunotherapy the effective rate is low: the microenvironment of the tumor suppressor cells, negative regulatory molecules, is an important reason for the failure of tumor immune escape and immunotherapy. Myeloid derived suppressor cells (myeloid-deprived, suppressor, cells, MDSC) is a kind of Immature myeloid cells, inhibition of.MDSC function in NPC amplification, activation, inhibition of cytotoxic T cells, promote tumor invasion and metastasis of.STING signaling pathway, double stranded DNA abnormal immune system recognition in the cytoplasm, important innate immune pathways play: herpes simplex virus, Mycobacterium tuberculosis and other pathogens DNA, enter the dendritic cell cytoplasm, the pathway is activated, dendritic cells synthesize large amounts of type I interferon, promoting antigen presentation, the initiation of adaptive immune responses. Nearly two years of study showed that tumor derived DNA can activate STING signaling pathway, start the antitumor immune response. The purpose of the STING signaling pathway in the activation of the state of NPC, and the clinical significance of the relationship between the MDSC pathway and the differentiation of exploration. The activation of the experimental materials and methods 1. detection of STING signal pathway by immunohistochemistry (A, ELSI The enzyme-linked immunosorbent assay), Western blot, detection of clinical samples (tumor and paracancerous tissue, serum of patients and healthy people) and cell lines (cancer cells, normal nasopharyngeal epithelial cell line) the expression of STING in.2. pathway analysis on the effect of STING signaling pathway of MDSC expression by siRNA differentiation: silence, the co culture system of phosphate mutation technology and cancer cells and CD33+ cells, flow cytometry analysis of effects of STING signal pathway on the differentiation of MDSC. Co culture system was collected, ELISA IL-6 GM-CSF, IL-1 assay, cell factor beta.3. screening regulation of STING miRNA: combined with bioinformatics prediction, using qPCR. Western Blot and luciferase reporter assay, screening and clinical significance of NPC STING in the miRNA.4. verification regulation of STING signal pathway: clinical data collection, statistical analysis of STING signal pathway With the level of MDSC, EB staging DNA virus load, and correlation of prognosis. The experimental results of 1. STING signaling pathway in NPC down-regulation: expression of STING in the cancer tissues was significantly lower than that in paired adjacent tissues (n=22, p0.001), the concentration of STING in serum of patients were significantly lower than those of healthy people (p=0.025). Cancer cell lines (TW03, CNE2) expression in STING, lower than that of normal nasopharyngeal epithelial cell line (NP69); after HSV-1 stimulation, TW03, CNE2 p-TBK1, p-IRF3 level and IFN- beta mRNA transcription level, lower than the down-regulation of NP69.2. STING signaling pathway promotes the differentiation of MDSC: compared to the control group. The expression of STING TW03, the number of MDSC induced significantly reduced (P0.05), inhibition on the proliferation of T cells was significantly decreased (P0.05); the knockdown of TW03 in STING or STING phosphorylation site mutation induced by siRNA technology, MDSC on the contrary. The tumor tissue of patients with In the expression of STING and CD33, a significant negative correlation (n=50, p0.001) regulates the expression of.3.miR-24 STING: bioinformatics prediction, STING is a direct target of miR-24; TW03, miR-24 overexpression in CNE2 cells, the expression of STING could be down regulated by the transcription of mRNA and STING protein; luciferase reporter gene the experiment confirmed that miR-24 can be directly combined with the clinical significance of the expression of STING STING 3'UTR.4. in tumor tissues: the expression of STING in tumor tissues of patients with the correlation is linear with the concentration of STING in serum (n=50, r=0.5928, P0.0001), and baseline EB virus DNA load negative correlation (n=50, P=0.041), is associated with recurrence the survival time of accept synchronization after radiotherapy (n=89, p=0.041). Conclusion: the down-regulation of STING signaling pathway in nasopharyngeal carcinoma, promote MDSC differentiation, enhance the immunosuppressive function of MDSC, is one of the factors of poor prognosis. In addition, miR-24 in the nose Overexpression in the cancer of the pharynx may be one of the reasons for the decline of STING expression.

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.63

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