本文關(guān)鍵詞： 乳腺癌 TLR4 HMGB1 ASCL2 乳腺癌干細(xì)胞 預(yù)后　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：乳腺癌是臨床上女性最為常見的惡性腫瘤之一,在現(xiàn)今世界惡性腫瘤發(fā)生率中排名第三位,同時(shí)也是女性最常見的惡性腫瘤和引起女性相關(guān)死亡的主要腫瘤病因。相關(guān)統(tǒng)計(jì)顯示,乳腺癌的發(fā)病率正呈現(xiàn)出逐年增多的趨勢。對乳腺癌的不斷研究及乳腺癌治療方法的進(jìn)步,乳腺癌的治療效果有了一定的改善。世界衛(wèi)生組織根據(jù)乳腺癌組織學(xué)特征,蛋白免疫組化表達(dá)特征,基因型特征及臨床治療靶點(diǎn)等因素,將乳腺癌分為不同的分子亞型。其中l(wèi)uminal型(包括A和B)是乳腺癌的最主要類型,占乳腺癌患者比例70%左右,預(yù)后最差的為三陰性乳腺癌。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)是生物免疫反應(yīng)中一個(gè)重要的模式識(shí)別受體,它能識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)及內(nèi)源性配體,從而激活免疫系統(tǒng)和炎性介質(zhì)的釋放,引發(fā)適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)。Toll樣受體除了在免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中調(diào)高的表達(dá)外,Toll樣受體在部分組織的正常上皮細(xì)胞也有表達(dá),比如胃、肺泡的上皮細(xì)胞等。新進(jìn)的研究表明,Toll樣受體在多種腫瘤細(xì)胞中有表達(dá),并且發(fā)現(xiàn)Toll樣受體的高表達(dá)與惡性腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。我們在TCGA數(shù)據(jù)庫中篩查到TLR4在乳腺癌隨訪死亡病例中顯著高表達(dá),這提示TLR4是乳腺癌中關(guān)鍵的預(yù)后指標(biāo)。同時(shí)TLR4在luminal型(包括A和B)是乳腺癌和三陰性乳腺癌這兩個(gè)亞群中也與預(yù)后顯著相關(guān)。為了進(jìn)一步分析TLR4在乳腺癌中的作用機(jī)制,我們體外分選了TLR4陽性的乳腺癌細(xì)胞(luminal型乳腺癌細(xì)胞系MCF-7,三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231),結(jié)果顯示TLR4陽性MCF-7細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞干性密切相關(guān),而TLR4陽性MDA-MB-231細(xì)胞則有很強(qiáng)EMT特征。同時(shí)我們還檢測了TLR4內(nèi)源性配體HMGB1在乳腺癌組織中的表達(dá),以期通過HMGB1和TLR4的聯(lián)合檢測分析,為乳腺癌診療提出新的檢測指標(biāo)和治療方案。ASCL2(Achaet scute-like 2,ASCL2)是一個(gè)和腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,已被證明在腫瘤組織中高表達(dá),能夠促進(jìn)腫瘤的增殖和侵襲,和腫瘤患者的預(yù)后差有密切的關(guān)聯(lián)。近期研究表明,ASCL2既可以受WNT信號(hào)通路的調(diào)節(jié),也可以和趨化因子受體(Chemokine receptor 4,CXCR4)結(jié)合來促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,并提示ASCL2與結(jié)腸癌干細(xì)胞的 干性‖有明顯的相關(guān)性。ASCL2在乳腺癌中的表達(dá)與乳腺癌臨床病理學(xué)之間的研究尚未開展。我們收集了191例在第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院手術(shù)切除的女性乳腺癌標(biāo)本。首先檢測了ASCL2在臨床乳腺癌標(biāo)本中的表達(dá),并結(jié)合乳腺癌患者臨床病理特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,驗(yàn)證ASCL2表達(dá)和患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。通過ASCL2和TLR4在乳腺癌組織表達(dá)的分析,試圖發(fā)現(xiàn)TLR4和ASCL2之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系,為乳腺癌干性調(diào)控提供新的思路。隨著基因檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和基因組學(xué)研究的逐漸深入,和乳腺癌相關(guān)的基因不斷被發(fā)現(xiàn)。檢測患者乳腺癌相關(guān)基因的擴(kuò)增、突變和表達(dá)異常情況,對早期診斷、預(yù)后判斷以及治療方案決策等具有重要意義,BRCA1,BRCA2等基因已被證明和乳腺癌的易感性相關(guān)。Yang等已經(jīng)發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織TLR4基因的多態(tài)性和乳腺癌的預(yù)后有明顯的關(guān)聯(lián)性。我們通過收集24位乳腺癌患者的血樣,在germline水平上對TLR4基因的多態(tài)性進(jìn)行檢測,研究分析其與乳腺癌易感性的關(guān)系。主要結(jié)果和結(jié)論如下:1.乳腺癌死亡病例的TLR4表達(dá)顯著增強(qiáng),并與乳腺癌干性指標(biāo)ALDH1A1顯著相關(guān)(1)TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示:乳腺癌死亡組(death)與無病生存組(DFS),兩組TLR4表達(dá)值(平均值)分別為:0.5131和0.0163,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析t=3.441 df=258,P值為0.0007,兩組間有極顯著差異;(2)TCGA數(shù)據(jù)庫分析luminal型乳腺癌中TLR4在死亡組(death)和無病生存組(DFS)表達(dá)有顯著差異(P0.05);(3)數(shù)據(jù)庫分析三陰性乳腺癌中TLR4在死亡組(death)和無病生存組(DFS)表達(dá)有顯著差異(P0.05);(4)進(jìn)一步分析顯示:luminal型乳腺癌死亡病例的TLR4表達(dá)與ALDH1A1表達(dá)的相關(guān)性的r2值為0.8316(P0.0001);三陰性乳腺癌死亡病例的TLR4表達(dá)與ALDH1A1表達(dá)的相關(guān)性的r2值為0.478(P0.0001)。2.TLR4陽性的乳腺癌細(xì)胞具有干性特征(1)流式分選TLR4+MCF-7細(xì)胞(luminal型),進(jìn)行ALDH1的檢測,結(jié)果示:TLR4陽性的MCF-7細(xì)胞中,ALDH1陽性細(xì)胞比例高達(dá)76.0%;TLR4陰性MCF-7細(xì)胞中,ALDH1陽性細(xì)胞比例為2.30%;(2)檢測乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(三陰性乳腺癌),TLR4陽性細(xì)胞比例占ALDH1的69.4%;(3)分選的TLR4陽性的乳腺癌細(xì)胞MCF-7的干性轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2、Nanog的表達(dá)顯著增高,并且成球能力顯著增強(qiáng);(4)TLR4陽性的MDA-MB-231的EMT相關(guān)分子Vimentin、β-catenin均表達(dá)顯著增高;(5)人乳腺癌免疫組化雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:乳腺癌細(xì)胞TLR4與ALDH1A1的表達(dá)共定位。3.HMGB1激活TLR4增強(qiáng)了luminal型乳腺癌細(xì)胞對Tamoxifen的耐藥性(1)Tamoxifen處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7后,TLR4及干性轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2、Nanog表達(dá)增高,并呈劑量依賴;(2)CCK8檢測細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示:TLR4陽性MCF-7細(xì)胞的tamoxifen抗性強(qiáng)于TLR4陰性MCF-7細(xì)胞;(3)HMGB1處理后,TLR4陽性MCF-7細(xì)胞的tamoxifen抗性顯著增強(qiáng)。4.HMGB1激活TLR4增強(qiáng)了三陰性乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力(1)Transwell實(shí)驗(yàn)顯示:加入TLR4外源性激活劑LPS后,穿出的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞數(shù)量明顯增多;(2)加入TLR4內(nèi)源性激活劑HMGB1后,Transwell實(shí)驗(yàn)顯示穿出的乳腺癌細(xì)胞數(shù)量也明顯增多;(3)加入TLR4的拮抗劑TAK-242后,穿出的乳腺癌細(xì)胞數(shù)量明顯減少;(4)當(dāng)TLR4的配體HMGB1被拮抗后乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的侵襲能力顯著減弱:GLY(HMGB1拮抗劑)處理后,Transwell實(shí)驗(yàn)顯示穿出的乳腺癌細(xì)胞數(shù)量明顯減少。5.人乳腺癌組織標(biāo)本中TLR4及HMGB1的表達(dá)狀況及聯(lián)合檢測意義(1)人乳腺癌標(biāo)本中TLR4高表達(dá)患者的乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著增高,但TLR4高表達(dá)組乳腺癌患者的總體生存期和無病生存期與低表達(dá)組無明顯差異(p值分別為0.751和0.162);在luminal型乳腺癌和三陰性乳腺癌TLR4高表達(dá)患者也未檢出有顯著臨床意義;(2)HMGB1蛋白(TLR4內(nèi)源性配體)表達(dá)主要定位在細(xì)胞核和細(xì)胞漿,HMGB1在細(xì)胞核高表達(dá)比率75.4%(144/191),在細(xì)胞漿高表達(dá)比率為50.3%(96/191);(3)HMGB1細(xì)胞漿高表達(dá)組的腫瘤體積增大,KI-67表達(dá)增高(P0.05),而HMGB1在細(xì)胞核高表達(dá)組無顯著腫瘤惡性特征;(4)人乳腺癌標(biāo)本中TLR4和HMGB1免疫組化雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,乳腺癌細(xì)胞TLR4高表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞核HMGB1往往低表達(dá),而TLR4低表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞核HMGB1高表達(dá);(5)人乳腺癌標(biāo)本中TLR4和HMGB1聯(lián)合檢測結(jié)果顯示:TLR4-HMGB1陽性組的乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、臨床分期均有顯著意義(P0.05),并且TLR4-HMGB1陽性組的總體生存率和無復(fù)發(fā)生存率均顯著低于TLR4-HMGB1陰性組(P0.05)。6.人乳腺癌組織標(biāo)本中ASCL2的表達(dá)與TLR4表達(dá)顯著正相關(guān),ASCL2高表達(dá)患者預(yù)后不良(1)免疫組化檢測人乳腺癌組織標(biāo)本中ASCL2的表達(dá),其免疫組化評分與TLR4的評分顯著正相關(guān)。(2)乳腺癌患者中,79例(41.4%)樣本檢測出ASCL2高表達(dá),112例(58.6%)樣本ASCL2低表達(dá)。并且腫瘤組織中ALSCL2表達(dá)顯著高于癌旁組織。在乳腺癌細(xì)胞系中,ASCL2表達(dá)定位于乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿。(3)ASCL2在乳腺癌中的表達(dá)同腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。ASCL2表達(dá)情況與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ki67的表達(dá)顯著相關(guān),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但與年齡、臨床分期、分子分型無顯著相關(guān)(P0.05)。(4)ASCL2是乳腺癌患者獨(dú)立的預(yù)后或復(fù)發(fā)指標(biāo)。Kaplan-Meier分析表明ASCL2高表達(dá)是乳腺癌患者術(shù)總體生存率(Overallsurvival,OS)和無病生存率(Disease-free survival,DFS)的影響因素(P0.05)。多因素Cox回歸分析表明ASCL2表達(dá)水平是影響乳腺癌患者預(yù)后(HR=1.865,P=0.001)和復(fù)發(fā)(HR=1.278,P=0.055)的獨(dú)立因素。7.乳腺癌患者外周血TLR4基因檢測顯示TLR4是潛在的乳腺癌易感性檢測基因(1)在24例乳腺癌患者外周血TLR4基因檢測中,1例患者在Chr9:120474941(H179N)位置上存在雜合堿基突變,由CAC(編碼組氨酸)突變?yōu)锳AC(編碼天冬氨酸);(2)突變患者臨床信息顯示對Tamoxifen治療反應(yīng)不佳。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9

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