發(fā)布時間：2018-02-12 22:38

  本文關鍵詞： 食管鱗狀細胞癌 腫瘤相關抗原 自身抗體 早期診斷 logistic回歸模型　出處：《鄭州大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的使用血清蛋白質組學分析技術(serological proteome analysis,SERPA)篩選、檢索基因組學與食管鱗癌診斷相關文獻、系統(tǒng)綜述抗腫瘤相關抗原(tumor associated antigens,TAAs)自身抗體與食管癌診斷相關研究,回顧總結本課題組前期研究結果,鑒定可能的特異性候選食管鱗狀細胞癌(食管鱗癌,esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)相關抗原,設計并優(yōu)化出可以用于ESCC診斷的抗-TAAs自身抗體組合,構建相應的ESCC患病預測模型,對所優(yōu)化組合用于ESCC早期診斷的可能性和可行性進行全面的評價,并使用一組獨立的人群樣本資料對所構建的患病預測模型的診斷價值進行驗證,為建立一種新的食管鱗癌早期體外非侵入性診斷技術提供依據和資料。方法1.蛋白質組學技術篩選和鑒定可能的候選ESCC相關抗原。1)Western blot方法初步篩選候選ESCC相關抗原及對應抗體陽性的患者血清:使用102例ESCC患者血清和58例正常對照血清與食管鱗癌細胞系TE-2、TE-8、EC1和EC9706全蛋白進行Western blot雜交,篩選ESCC患者血清中對應自身抗體陽性率≥10%,并且對應自身抗體在ESCC患者血清中陽性率大于正常對照血清中陽性率(p0.05)的反應條帶所對應的蛋白作為可能的候選ESCC相關抗原,同時挑選出針對候選ESCC相關抗原特異性陽性反應的ESCC患者血清。2)使用免疫熒光方法進一步驗證Western blot篩選出來的針對候選ESCC相關抗原呈陽性反應的患者血清,并觀察候選腫瘤相關抗原的細胞學定位。3)使用SERPA技術篩選和鑒定候選食管鱗癌相關抗原:裂解TE-8細胞株全蛋白,在相同條件下同時進行三根IPG預制膠條的等電聚焦電泳,SDS-PAGE凝膠電泳后,其中一塊凝膠使用考馬斯亮藍R250染色,另外兩塊凝膠電轉到硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,NC膜)后分別與上述挑選出的陽性ESCC患者血清和正常對照血清進行Western blot雜交,雜交后的結果與考馬斯亮藍R250染色凝膠進行比對,將血清學反應陽性的蛋白點進行質譜分析和鑒定,確定所篩選出候選ESCC相關抗原的種類和詳細信息。2.候選TAAs的原核表達和純化:在基于SERPA方法篩選候選TAAs的基礎上,檢索基因組學與食管鱗癌相關文獻,系統(tǒng)綜述抗-TAAs自身抗體與食管癌診斷相關文獻報道,結合本課題組前期相關研究結果,對可能的食管鱗癌候選TAAs進行原核表達和純化。1)候選TAAs原核表達載體的構建:提取EC9706細胞株總RNA,逆轉錄為cDNA,使用特異性PCR引物擴增出目的基因,連接入克隆載體后進行酶切鑒定和測序分析,鑒定正確的目的基因連接入原核表達載體pET-28a中。2)候選TAAs的原核表達和純化:將重組表達質粒轉化入宿主表達菌中,優(yōu)化IPTG誘導蛋白表達濃度,對表達蛋白進行可溶性分析�？扇苄员磉_蛋白使用不同濃度的咪唑進行純化,不可溶性表達蛋白使用不同pH值的8M尿素進行純化,并對純化后的蛋白進行濃度測定。3)純化蛋白的免疫學活性鑒定:使用特異性抗體與所純化蛋白進行Western blot雜交,鑒定所純化蛋白是否具有免疫學活性。3.候選TAAs自身抗體在ESCC診斷中的價值評價以及ESCC患病預測模型的建立與驗證。1)單個抗-TAA自身抗體指標對食管鱗癌的診斷價值評價:采取間接酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法檢測每種抗-TAA自身抗體在不同研究對象血清中的相對表達量,使用秩和檢驗或獨立樣本t檢驗比較每種抗-TAA自身抗體在ESCC患者組和正常對照組血清中的表達量差異;以受試組(包括324例ESCC患者和324例正常對照)中每個研究對象血清中每種抗-TAA自身抗體的表達含量為自變量,ESCC患病事件作為因變量,采取logistic回歸的方法得出每種抗-TAA自身抗體的表達與ESCC患病事件的回歸方程并計算出各個研究對象患食管鱗癌的預測概率,以預測概率=0.5作為截斷值,判定每種自身抗體用于診斷ESCC的靈敏度和特異度,受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC曲線)分析評價每種自身抗體對ESCC的診斷價值。將ESCC患者分為早期ESCC組(TNM分期為0,I和II期)和晚期ESCC組(TNM分期為III和IV期),統(tǒng)計并比較各自身抗體指標對不同分期ESCC患者診斷的陽性率,以判定是否具有特異性的早期ESCC相關抗原指標。2)建立ESCC患病預測模型:以受試組人群為研究對象,根據每個研究對象血清中檢測自身抗體的含量與ESCC患病事件,采用后退(條件)逐步logistic回歸法篩選自變量并構建相應的預測模型,計算出各個研究對象患食管鱗癌的預測概率,以預測概率=0.5作為截斷值,判定患病預測模型用于診斷ESCC的靈敏度和特異度,并使用ROC曲線分析評價該模型對受試組中ESCC患者的診斷價值。逐一剔除納入自變量后對預測模型診斷價值(包括靈敏度、特異度、AUC以及判定結果符合率等)貢獻最小的抗-TAA自身抗體指標,構建新的預測模型,并判定所構建預測模型對ESCC的診斷價值,以優(yōu)化抗-TAAs自身抗體組合。3)預測模型的驗證:以驗證組人群(包括186例ESCC患者和186例正常對照)為研究對象,將各個研究對象對應TAAs自身抗體含量代入上述構建預測模型中,根據預測概率確定食管鱗癌患病事件,使用ROC曲線分析評價構建模型在驗證組中對ESCC的診斷價值。4)所構建預測模型對不同分期ESCC患者的診斷:分別評價并比較上述構建預測模型對受試組和驗證組早期ESCC患者和晚期ESCC患者的診斷價值,以分析預測模型是否具有早期ESCC診斷特異性。使用預測模型對研究對象中所有早期ESCC患者與正常對照進行判定,以預測模型從正常人群中區(qū)分出早期ESCC患者的能力,從而進一步評價預測模型對于早期ESCC的診斷價值。結果1.使用蛋白質組學技術篩選和鑒定出四種候選的食管鱗癌相關抗原Western blot方法篩選發(fā)現分子量在40kD、50kD以及65kD附近的三條蛋白條帶的自身抗體在ESCC患者血清中陽性率明顯高于正常對照血清;質譜鑒定結果顯示SERPA方法篩選出的候選TAAs分別為hnRNP1A2B1 isform A2(異質核核糖核蛋白A2/B1的A2亞型,36kD)、CALR(鈣網蛋白,48kD)、ENO1(烯醇酶-1,47kD)和HSPD1(熱休克蛋白60,61kD)。2.成功構建了hnRNPA2B1、CALR、HSPD1和NICD(NOTCH1胞內段)四種重組蛋白的原核表達載體,并成功表達和純化出這四種候選TAAs重組蛋白,且所純化出的蛋白均具有免疫學活性。3.對研究對象中15種TAAs(hnRNPA2B1、CALR、ENO1、HSPD1、p53、NICD、c-myc、p62/IMP2、MDM2、p90/CIP2A、p16/INK4A、HCCR/LETMD1、IMP1、Koc/IMP3和Cyclin E)自身抗體水平進行分析,成功建立起一種基于10種TAAs(p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1、NICD、ENO1、Koc和IMP1)的食管鱗癌患病logistic回歸預測模型,該預測模型應用于受試組研究對象ESCC診斷的靈敏度為71.6%,特異度為85.2%,AUC為0.871(95%CI:0.843-0.896),判定結果符合率為78.4%。對抗-TAAs自身抗體組合進行進一步優(yōu)化,基于9種抗-TAAs抗體組合(p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1、NICD、ENO1和Koc)的預測模型用于ESCC診斷所對應的AUC最大(AUC=0.872,95%CI:0.844-0.897),而基于7種自身抗體(p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1和NICD)的預測模型對研究對象是否患病的判定結果符合率最高(判定結果符合率為79.2%)。該7種自身抗體預測模型對于受試組食管鱗癌診斷的AUC為0.864,靈敏度為71.9%,特異度為86.4%,對于驗證組食管鱗癌診斷的AUC為0.862,靈敏度為65.6%,特異度為90.3%。與其它組合相比,該7種自身抗體組合具有較高的診斷效能和更高的性價比,并且該模型能夠較好的從正常人群中區(qū)分出早期ESCC患者,對早期ESCC患者診斷的AUC為0.864,靈敏度為71.9%,特異度為87.8%,總判定結果符合率為83.7%。結論1.hnRNP1A2B1、CALR、ENO1和HSPD1可能是候選的食管鱗癌相關抗原。2.基于7種抗-TAAs自身抗體組合(p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1和NICD)的預測模型能夠對食管鱗癌,尤其是早期食管鱗癌提供一定的診斷價值。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.1

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