本文關(guān)鍵詞： 肺癌 低頻遺傳變異 遺傳易感性 預(yù)后 全外顯子組關(guān)聯(lián)研究　出處：《南京醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一。目前其發(fā)病率和死亡率均位居全球范圍內(nèi)惡性腫瘤的首位。近年來,肺癌持續(xù)占據(jù)我國男性新發(fā)惡性腫瘤的首位,女性新發(fā)惡性腫瘤的第二位;而且由于肺癌預(yù)后差,在我國全腫瘤死因中,肺癌始終占據(jù)首位。過去數(shù)十年中,持續(xù)增長的煙草消費和不斷加重的環(huán)境污染,導致我國多數(shù)地區(qū)的肺癌發(fā)病率和死亡率仍呈現(xiàn)不斷上升趨勢,肺癌是嚴重危害我國居民健康和生命的重要公共衛(wèi)生問題之一。流行病學研究表明,肺癌的發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。盡管80%以上的男性肺癌和至少50%的女性肺癌可歸咎于煙草暴露,但在相同的煙草暴露下,僅不到20%的吸煙者最終發(fā)展為肺癌,提示遺傳因素在肺癌發(fā)生中起重要作用。臨床分期和組織病理類型是判斷患者預(yù)后的主要臨床指標,但臨床分期和組織病理類型相同的個體接受同樣的治療方案,治療效果往往差異很大,提示不同的肺癌患者對治療敏感性的情況不同,個體的遺傳背景可能會影響患者的臨床預(yù)后。因此,篩選有效的遺傳標志物用于肺癌高危人群的鑒定,指導肺癌個體化預(yù)防,預(yù)測肺癌患者預(yù)后,指導肺癌的個體化治療,是目前國內(nèi)外研究的熱點。近年來,隨著人類對基因組認識的不斷深入,以及高通量技術(shù)平臺的建立和完善,全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide association studies,GWAS)已經(jīng)成為探索復雜疾病遺傳易感性和篩選預(yù)后遺傳標志物的有力工具。該策略能快速篩查全基因組范圍內(nèi)的常見遺傳標志,通過大樣本量的初篩和后期多個獨立研究的驗證,研究結(jié)果往往具有較高的重現(xiàn)性和可靠性。本課題組前期開展了首個中國漢族人群肺癌GWAS研究,研究結(jié)果不僅驗證了前期報道的肺癌易感區(qū)域(3q28和5P15.33區(qū)域等),還發(fā)現(xiàn)了一批新的中國漢族人群肺癌易感區(qū)域(5q32、10p14、13q12.12、20q13.2 和 22q12.2 區(qū)域)。在肺癌預(yù)后的 GWAS 研究中,我們發(fā)現(xiàn) 3p22.1、4q26、5p14.1、7q31.31、9p21.3 和 14q24.3 區(qū)域的遺傳變異可能與肺癌患者的生存時間顯著相關(guān)。肺癌易感性及預(yù)后的GWAS研究,較系統(tǒng)地揭示了常見遺傳變異與肺癌易感性及預(yù)后的關(guān)系,為肺癌的病因?qū)W研究、預(yù)后療效評估和治療靶標篩選提供了非常有價值的線索。然而,既往的GWAS研究策略是基于"常見疾病/常見變異"的遺傳假說,因此早期GWAS芯片通常利用單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)的連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)原理,通過標簽SNP代表整個基因組的常見遺傳變異(較小等位基因頻率,MAF≥5%),難以對低頻遺傳變異進行系統(tǒng)研究。常見變異頻率較高但外顯性較低,目前發(fā)現(xiàn)的常見遺傳變異僅能解釋部分的遺傳性狀,至今尚存在大量的"遺傳性丟失"。近年來,研究者提出了"常見疾病/低頻變異"的假說,認為低頻變異(MAF5%)往往具有較高的外顯性,對常見疾病或性狀的貢獻同樣重要,可能解釋部分的"遺傳性丟失"。高通量測序是低頻遺傳變異關(guān)聯(lián)研究最理想的策略,但高昂的價格限制了該方案的廣泛應(yīng)用。為了提供系統(tǒng)探索低頻遺傳變異關(guān)聯(lián)研究的可行技術(shù)平臺,Illumina公司基于12031個個體的全基因組測序和外顯子測序數(shù)據(jù),系統(tǒng)篩選了不同人種(包括亞洲人、歐洲人、非裔美國人和西班牙人),不同疾病(如2型糖尿病、癌癥、代謝及精神疾病等)相關(guān)基因的約240000個遺傳變異,推出了一款高通量芯片-Infinium(?)HumanExome Beadchip。該芯片的93.1%位點位于外顯子區(qū),其余位點位于啟動子區(qū)、終止密碼子區(qū)、剪接區(qū)等,其中89.5%的位點為低頻遺傳變異。因此,為了探索低頻單核苷酸遺傳變異(Single Nucleotide Variant,SNV)在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用,本研究采用"外顯子組芯片(Infinium(?)HumanExome Beadchip)"的分型技術(shù),基于大樣本多階段的病例-對照研究設(shè)計,研究低頻遺傳變異與中國人群肺癌發(fā)生風險的關(guān)聯(lián);在此基礎(chǔ)上,我們進一步整合肺癌患者臨床和預(yù)后信息,探討低頻遺傳變異對肺癌患者預(yù)后的影響。本研究結(jié)果對于進一步發(fā)現(xiàn)中國人群的肺癌遺傳標志物,提高肺癌風險預(yù)測效能,深入理解肺癌的預(yù)后差異機制,促進個體化治療具有重要的理論和現(xiàn)實意義。第一部分低頻遺傳變異與肺癌遺傳易感性關(guān)聯(lián)研究肺癌GWAS研究發(fā)現(xiàn)的超過30個肺癌易感位點(區(qū)域),僅能解釋不到1%的肺癌遺傳度,目前尚存在大量未知的遺傳缺失有待進一步挖掘。傳統(tǒng)GWAS研究通常只關(guān)注常見遺傳變異,而忽略了低頻遺傳變異的貢獻。而近期,Wang等人整合前期歐美人群的多項肺癌GWAS研究,按照統(tǒng)一的質(zhì)控和填補流程進行了全基因組整合分析,最終發(fā)現(xiàn)了 2個低頻錯義位點BRCA2(p.Lys3326X,MAF=0.009,OR=2.47,P= 4.74 × 10-20)和CHEK2(p.Ile157Thr,MAF=0.007,OR=0.38,P=1.27×10-13)與肺鱗癌易感性顯著相關(guān),且效應(yīng)遠大于既往發(fā)現(xiàn)的常見遺傳變異,該研究證明了外顯子區(qū)低頻遺傳變異在肺癌易感性中的重要作用。然而,目前尚無低頻遺傳變異與中國漢族人群肺癌遺傳易感性研究的報道,因此我們開展了首個中國人群肺癌全外顯子組關(guān)聯(lián)研究。本研究采用大樣本多階段的病例-對照研究設(shè)計,在初篩階段采用Illumina HumanExome Beadchip芯片對1348例肺癌病例和1988例健康對照進行基因分型。然后我們進行了系統(tǒng)的質(zhì)量控制,剔除質(zhì)量不合格的樣本(包括分型成功率低、存在親緣關(guān)系、存在明顯人群分層以及與前期GWAS芯片分型不一致)和位點(包括線粒體和性染色體位點、重復位點、分型成功率不合格位點、偏離Hardy-Weinberg位點以及頻率為0的位點),最終1341例肺癌病例和1982例健康對照的72423個位點納入后續(xù)關(guān)聯(lián)分析。針對關(guān)聯(lián)分析結(jié)果,我們篩選P1×10-3且分型可靠的低頻錯義或剪切位點,在4699例肺癌病例和4915例健康對照中進行了兩階段驗證。對驗證一致的遺傳變異,我們采用單純病例研究設(shè)計,評價了這些遺傳變異對于肺癌發(fā)病年齡的影響�；诘皖l錯義和剪切位點,我們開展了基因水平的關(guān)聯(lián)分析。最后,基于The Cancer Genome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù)庫,我們進一步評價了易感基因在肺癌發(fā)生中的潛在作用。研究結(jié)果顯示,位于BAT2,FKBPL和BPIFB1上的3個低頻錯義遺傳變異與肺癌發(fā)生風險顯著相關(guān):rs9469031(6p21.33,BAT2 c.1544CT[p.Pro515Leu];OR=0.55,P=1.28×10-10);rs200847762(6p21.33,FKBPL c.410CT[p.Pro137Leu];OR=0.25,P=9.79× 1012)和 rs6141383(20q1 1.21,BPIFB1c.850GA[p.Val284Met];OR=1.72,P=1.79×10-7)。在單純病例分析中,我們發(fā)現(xiàn) rs9469031-C(P=0.001)和rs6141383-A(P=0.006)與肺癌的早發(fā)顯著相關(guān)。基因水平關(guān)聯(lián)分析提示FKBPL可能是6p21.33區(qū)域肺癌易感性的關(guān)鍵基因(SKAT-O檢驗:P=1.29×10-9;Burden檢驗:P=2.00×10-10)�；赥CGA基因表達數(shù)據(jù)庫,我們發(fā)現(xiàn)BAT2,FKBPL和BPIFB1在肺癌與癌旁組織中均顯著差異表達。上述結(jié)果表明,6p21.33和20q11.21區(qū)域的低頻遺傳變異可能與中國漢族人群肺癌的易感性相關(guān),低頻遺傳變異在肺癌發(fā)生中可能發(fā)揮重要作用。我們的研究進一步完善了中國人群的遺傳易感圖譜,研究結(jié)果對深入理解肺癌的發(fā)生機制、指導高危人群篩查和個體化預(yù)防有重要的理論意義和潛在應(yīng)用價值。第二部分低頻遺傳變異與肺癌預(yù)后關(guān)聯(lián)研究基于GWAS的研究策略,前期多項研究系統(tǒng)探討了常見遺傳變異與中國漢族人群肺癌預(yù)后的關(guān)聯(lián),發(fā)現(xiàn)了一批影響中國漢族人群肺癌預(yù)后的關(guān)鍵區(qū)域,包括染色體 2p23、2q22、2q34、3p22、5p14、6p21、7q31、9p21、9p22、11q22、12q23、13q33、14q24、15q21、16q21、19p13 和 21q22 等。然而前期研究主要關(guān)注常見遺傳變異,低頻遺傳變異與肺癌預(yù)后關(guān)聯(lián)尚不清楚。因此,我們基于課題組前期積累,進一步整合肺癌患者的臨床和預(yù)后信息,開展了肺癌預(yù)后的全外顯子組關(guān)聯(lián)研究。本研究采用單純病例研究設(shè)計。在前述應(yīng)用Illumina HumanExome Beadchip芯片芯片完成檢測的1348例肺癌患者中,1008例具有完整臨床資料和預(yù)后隨訪信息的肺癌樣本納入本研究。經(jīng)過系統(tǒng)的質(zhì)量控制后,共1001例肺癌病例的57903個位點納入后續(xù)關(guān)聯(lián)分析,關(guān)聯(lián)分析使用Cox回歸模型。對于初篩階段滿足P1×10-3且分型可靠的低頻錯義或剪切位點,我們進一步在773例同時具有臨床隨訪、基因型及表達信息的TCGA肺癌樣本中進行了驗證。首先,我們使用SHAPE和IMPUTE2軟件進行了全基因組填補,由于填補后的TCGA數(shù)據(jù)僅能得到部分低頻位點的基因型信息,而低頻錯義或剪切位點往往只影響本體基因的功能,因此我們同時使用基因的表達水平與肺癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)作為我們研究結(jié)果的進一步佐證。對TCGA填補后的基因型和表達數(shù)據(jù),我們使用Cox模型計算了其與肺癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)。對于TCGA基因型或表達驗證一致的位點,均作為本研究的顯著關(guān)聯(lián)位點�；诘皖l錯義和剪切位點,我們使用R包'coxKM'進行了基因水平的關(guān)聯(lián)分析,并根據(jù)計算得到的P值使用R包'ARTP'開展了通路分析。研究發(fā)現(xiàn),2p23.2區(qū)域的低頻錯義位點rs117512489(PLB1[p.Arg1131Gln])與肺癌預(yù)后顯著相關(guān)(HR=2.02,P=7.28×10-4),且TCGA數(shù)據(jù)庫中其表達水平與肺癌預(yù)后相關(guān)(HR=1.15,P=0.023)。此外,我們還發(fā)現(xiàn)7p11.2區(qū)域的低頻錯義位點 rs33922584(CCT6Ap.Tyr229Cys])與肺癌預(yù)后顯著相關(guān)(HR=1.75,P=6.06×10-4),在TCGA數(shù)據(jù)庫中,其基因型(HR=4.19,P=0.015)和表達水平(HR=1.15,P=0.047)均與肺癌預(yù)后相關(guān)。進一步分析發(fā)現(xiàn),rs33922584可能損害CCT6A蛋白的結(jié)構(gòu)和磷酸化,且在TCGA的肺癌樣本中rs33922584與CCT6A的表達水平顯著相關(guān)(p=0.019)。差異表達分析發(fā)現(xiàn),CCT6A在肺癌的癌組織中顯著高表達(P=3.75×10-28)。在基因水平的關(guān)聯(lián)分析中,我們發(fā)現(xiàn)了包括CCT64在內(nèi)的32個肺癌預(yù)后相關(guān)基因,通路分析提示包括CTNNB1相關(guān)通路,細胞周期G2-M通路在內(nèi)的多條通路可能與肺癌的預(yù)后相關(guān)。經(jīng)過兩階段研究,我們最終發(fā)現(xiàn)2p23.2和7p11.2區(qū)域的兩個低頻錯義位點與肺癌預(yù)后顯著相關(guān),且其基因型或(和)表達水平在TCGA數(shù)據(jù)庫中關(guān)聯(lián)一致。同時,研究還提示了一批新的可能影響肺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵基因和通路。本研究結(jié)果對深入理解肺癌的預(yù)后機制,促進肺癌個體化治療,新靶標的研發(fā)具有重要的指導意義和潛在應(yīng)用價值。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

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1 朱猛;程陽;戴俊程;謝蘭;靳光付;馬紅霞;胡志斌;師詠勇;林東昕;沈洪兵;;基于全基因組關(guān)聯(lián)研究的中國人群肺癌風險預(yù)測模型[J];中華流行病學雜志;2015年10期

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本文編號：1505311