本文關(guān)鍵詞： 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 順鉑 長鏈非編碼 RNA miRNA MCL1 化療耐藥性凋亡 自噬　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:惡性膠質(zhì)瘤的化療效果極差,而且化療耐藥性的機制尚不清楚。1.本實驗首先利用化療常用藥物順鉑對人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞進行誘導(dǎo),再利用基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析手段鑒定出表達差異最明顯的長鏈非編碼RNAAC023115.3,并證實AC023115.3能夠通過自噬途徑調(diào)控順鉑引起的細(xì)胞凋亡。2.探究AC023115.3通過調(diào)控自噬進而影響順鉑引起的細(xì)胞凋亡的具體分子機制,從而闡明一條新的影響膠質(zhì)瘤化療耐藥性產(chǎn)生的信號通路,為優(yōu)化膠質(zhì)瘤的臨床治療提供新思路。方法:1.人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG經(jīng)不同劑量的順鉑誘導(dǎo)后,采用Western blot方法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達量的變化,建立耐受不同劑量順鉑的膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型;利用基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)手段篩選出在這些模型中差異表達的長鏈非編碼RNAs(LncRNAs),找出其中表達明顯上調(diào)的LncRNA(文中稱作AC023115.3),然后再用定量PCR(qPCR)的方法對表達水平明顯上調(diào)的LncRNA(文中稱作AC023115.3)進行驗證。此外,將U87MG用定量的順鉑處理不同時間,利用qPCR檢測AC023115.3表達量的變化是否具有時間依賴性。在U251MG細(xì)胞中利用以上的方法檢測AC023115.3的表達量變化,并證明這種變化是否具有劑量或時間依賴性。2.在U87MG細(xì)胞中使用siRNA敲低AC023115.3的表達水平,隨后進行順鉑誘導(dǎo),利用qPCR和RT-PCR的方法檢測AC023115.3表達量變化,用Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達量的變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測和分析凋亡細(xì)胞的比例變化。相比之下,在U87MG中過表達AC023115.3后用順鉑進行誘導(dǎo),檢測各個指標(biāo)變化。在U251MG細(xì)胞系中采用以上方法檢測AC023115.3對細(xì)胞凋亡的影響。3.分別在U251MG細(xì)胞中過表達或在U87MG細(xì)胞中敲低AC023115.3后進行順鉑誘導(dǎo),用熒光圖像觀察和分析細(xì)胞中LC3點狀形成狀態(tài),使用Western blot檢測細(xì)胞中LC3-Ⅱ型蛋白相對于I型蛋白的比例變化,以及p62蛋白表達量的變化,并用透射電鏡觀察和分析細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量變化,以明確AC023115.3對自噬的調(diào)控作用。4.使用靶向自噬相關(guān)基因5(atg5)的shrna分別轉(zhuǎn)染u87mg和u251mg細(xì)胞后用同等劑量的順鉑進行誘導(dǎo),隨后使用westernblot技術(shù)檢測自噬及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達量的變化,同時采用mtt方法評估細(xì)胞的生存能力。使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-ma)對u87mg和u251mg細(xì)胞后處理后進行順鉑誘導(dǎo),檢測自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達量的變化,以及細(xì)胞生存能力的變化。在u87mg細(xì)胞中用共轉(zhuǎn)染ac023115.3的sirna和atg5的shrna后,檢測順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的變化,明確ac023115.3引起的順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的改變與自噬的關(guān)系,同時并使用3-ma進行驗證。5.對u87mg和u251mg細(xì)胞進行順鉑誘導(dǎo)后使用westernblot檢測bcl2家族蛋白表達量的變化,對ac023115.3敲低的u87mg細(xì)胞進行順鉑誘導(dǎo),使用westernblot方法檢測mcl1蛋白表達量的變化,用qpcr和rt-pcr檢測u87mg細(xì)胞中ac023115.3對mcl1mrna表達水平的影響。使用蛋白半衰期實驗和泛素化實驗檢測ac023115.3對mcl1蛋白水平的影響。使用westernblot檢測ac023115.3對于mcl1磷酸化水平的影響(ser159位點)。對u87mg和u251mg細(xì)胞進行順鉑誘導(dǎo)后使用westernblot檢測gsk3β蛋白表達量的變化,隨后在u251mg細(xì)胞中過表達或在u87mg細(xì)胞中敲低ac023115.3后檢測gsk3β蛋白表達量的變化。在u87mg細(xì)胞中敲低ac023115.3同時過表達gsk3β、在u251mg細(xì)胞中過表達ac023115.3同時敲低gsk3β,隨后進行順鉑誘導(dǎo),使用westernblot檢測mcl1蛋白表達量的變化。通過以上幾方面的實驗明確ac023115.3、gsk3β、mcl1之間的調(diào)控關(guān)系。6.將u87mg細(xì)胞順鉑處理后利用qpcr檢測gsk3βmrna表達水平的變化。將敲低ac023115.3的u87mg細(xì)胞進行順鉑誘導(dǎo),qpcr檢測gsk3βmrna表達水平的變化。利用rip實驗檢測ago2抗體與ac023115.3結(jié)合情況,判斷ac023115.3是否與微小rna(mirna)結(jié)合,運用lncipedia數(shù)據(jù)庫預(yù)測ac023115.3結(jié)合的mirnas。對可能性最大的mir-26a利用報告基因?qū)嶒炦M行驗證。將ac023115.3序列、含有mir-26a結(jié)合位點的gsk3β3'utr(非編碼區(qū))序列、以及ac023115.3的突變序列分別構(gòu)建到報告基因載體中,驗證mir-26a與ac023115.3是否結(jié)合。隨后在u87mg和u251細(xì)胞中轉(zhuǎn)染含有g(shù)sk3β-3'utr序列的載體,順鉑誘導(dǎo)后檢測相對熒光素酶活性。在u87mg細(xì)胞中轉(zhuǎn)染含有g(shù)sk3β3'utr序列的載體,同時敲低ac023115.3或過表達mir-26a后進行順鉑誘導(dǎo),檢測相對熒光素酶活性,使用westernblot檢測gsk3β蛋白水平變化。通過在u87mg和u251mg細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染gsk3β3'utr、mir-26a、ac023115.3進行報告基因?qū)嶒?闡明ac023115.3、mir-26a和gsk3β三者之間的關(guān)系。7.在u87mg中共轉(zhuǎn)染外源性ac023115.3和帶有flag標(biāo)簽的mcl1后進行順鉑誘導(dǎo),使用westernblot檢測凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達量的變化。隨后在過表達ac023115.3的u251mg細(xì)胞中敲低gsk3β,檢測凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達量的變化。將mir-26a抑制劑或mir-26a模擬物導(dǎo)入u87mg細(xì)胞,順鉑誘導(dǎo)后檢測凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達量的變化。在導(dǎo)入有mir-26a抑制劑或mir-26a模擬物的u87mg細(xì)胞中過表達gsk3β后進行順鉑誘導(dǎo),westernblot檢測凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達量的變化。在u87mg細(xì)胞中敲低ac023115.3,同時導(dǎo)入mir-26a抑制劑,順鉑誘導(dǎo)后檢測凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達量的變化。在過表達ac023115.3的u87mg細(xì)胞中導(dǎo)入mir-26模擬物,順鉑誘導(dǎo)后westernblot檢測凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達量的變化。通過以上幾方面的實驗,闡明ac023115.3的生物學(xué)功能與mir-26a-gsk3β-mcl1信號通路的關(guān)系。結(jié)果:1.順鉑能促進膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡,基因芯片分析顯示順鉑引起的差異表達的lncrnas中ac023115.3的表達明顯上調(diào),且這種改變與藥物劑量或作用時間呈正相關(guān)。ac023115.3表達明顯上調(diào)可減弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞順鉑的耐藥性。2.westernblot及流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ac023115.3的表達下調(diào)使凋亡相關(guān)蛋白的表達降低,凋亡細(xì)胞數(shù)減少;與此相反,上調(diào)ac023115.3的表達可增強凋亡相關(guān)蛋白的表達,凋亡細(xì)胞數(shù)增多。ac023115.3促進順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。3.細(xì)胞熒光實驗、westernblot、透射電鏡超微結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果均表明,膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ac023115.3表達上調(diào)能降低自噬相關(guān)關(guān)鍵分子的表達。相反,ac023115.3表達下調(diào)能增強自噬相關(guān)的關(guān)鍵分子的表達。ac023115.3在順鉑誘導(dǎo)下能夠抑制自噬。4.使用自噬相關(guān)基因5(atg5)的shrna或自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-ma)處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞后,順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力相對增強,細(xì)胞生存力下降。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,由敲低ac023115.3引起的順鉑誘導(dǎo)的凋亡率的下調(diào)可被atg5的敲低或3-ma的使用所逆轉(zhuǎn)。ac023115.3通過抑制自噬來增強順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。5.westernblot結(jié)果顯示:膠質(zhì)瘤細(xì)胞用順鉑處理后mcl1的蛋白表達下調(diào),敲低ac023115.3可抑制對mcl1表達的下調(diào)作用,提高了mcl1蛋白的穩(wěn)定性,使順鉑誘導(dǎo)的mcl1的泛素化水平的增強作用被抑制。順鉑可促使mcl1蛋白的磷酸化水平發(fā)生變化并可增強gsk3β的表達,gsk3β的表達受ac023115.3正向調(diào)控。利用共轉(zhuǎn)染的方法證實了膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ac023115.3通過gsk3β下調(diào)mcl1的表達。6.ac023115.3對順鉑處理后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的gsk3βmrna表達水平無影響。rna免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示ac023115.3可能與mirna發(fā)生結(jié)合。并通過lncipedia預(yù)測和用報告基因?qū)嶒灪Y選出可能性最大的mirna(mir-26a)。運用報告基因?qū)嶒炓约肮厕D(zhuǎn)染的方法證明gsk3β、mir-26a、ac023115.3三者之間存在以下關(guān)系,即ac02115.3扮演著mir-26a吸附海綿的角色并促進gsk3β的表達。7.ac023115.3表達上調(diào)可以促進膠質(zhì)瘤細(xì)胞中順鉑誘導(dǎo)的凋亡并且降低自噬,但這種作用可被mcl1抑制。gsk3β的下調(diào)可抑制ac023115.3所產(chǎn)生的增強凋亡的作用,并能促進自噬。mir-26a抑制劑可增強順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并減弱自噬,外源性增加mir-26a表達水平可以減弱細(xì)胞凋亡并促進自噬;過表達gsk3β可消除mir-26a所發(fā)揮的這些作用。mir-26a在順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬中發(fā)揮的生物學(xué)功能依賴于gsk3β的表達。8.敲低ac023115.3能抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并促進自噬;mir-26a抑制劑可消除這些作用。相比之下,增強mir-26a的表達后可削弱ac023115.3過表達所引起的細(xì)胞凋亡。綜合以上結(jié)果,ac023115.3可通過調(diào)控mir-26a-gsk3β-mcl1通路來增強順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并抑制自噬。結(jié)論:1.ac023115.3可被順鉑誘導(dǎo)并抑制膠質(zhì)瘤的化療耐藥性。2.ac023115.3可通過減弱mcl1介導(dǎo)的自噬來促進順鉑誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。3.ac023115.3扮演著mir-26asponge的角色并抑制其活性。4.AC023115.3通過調(diào)控miR-26a-GSK3β-MCL1信號通路增強順鉑誘導(dǎo)的凋亡,提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的化療敏感性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.41

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本文編號：1505346