本文關鍵詞： 膠質(zhì)母細胞瘤 順鉑 長鏈非編碼 RNA miRNA MCL1 化療耐藥性凋亡 自噬　出處：《大連醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:惡性膠質(zhì)瘤的化療效果極差,而且化療耐藥性的機制尚不清楚。1.本實驗首先利用化療常用藥物順鉑對人膠質(zhì)母細胞瘤細胞進行誘導,再利用基因芯片技術和生物信息學分析手段鑒定出表達差異最明顯的長鏈非編碼RNAAC023115.3,并證實AC023115.3能夠通過自噬途徑調(diào)控順鉑引起的細胞凋亡。2.探究AC023115.3通過調(diào)控自噬進而影響順鉑引起的細胞凋亡的具體分子機制,從而闡明一條新的影響膠質(zhì)瘤化療耐藥性產(chǎn)生的信號通路,為優(yōu)化膠質(zhì)瘤的臨床治療提供新思路。方法:1.人膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87MG經(jīng)不同劑量的順鉑誘導后,采用Western blot方法檢測細胞凋亡相關蛋白表達量的變化,建立耐受不同劑量順鉑的膠質(zhì)瘤細胞模型;利用基因芯片技術和生物信息學手段篩選出在這些模型中差異表達的長鏈非編碼RNAs(LncRNAs),找出其中表達明顯上調(diào)的LncRNA(文中稱作AC023115.3),然后再用定量PCR(qPCR)的方法對表達水平明顯上調(diào)的LncRNA(文中稱作AC023115.3)進行驗證。此外,將U87MG用定量的順鉑處理不同時間,利用qPCR檢測AC023115.3表達量的變化是否具有時間依賴性。在U251MG細胞中利用以上的方法檢測AC023115.3的表達量變化,并證明這種變化是否具有劑量或時間依賴性。2.在U87MG細胞中使用siRNA敲低AC023115.3的表達水平,隨后進行順鉑誘導,利用qPCR和RT-PCR的方法檢測AC023115.3表達量變化,用Western blot檢測凋亡相關蛋白表達量的變化,流式細胞術檢測和分析凋亡細胞的比例變化。相比之下,在U87MG中過表達AC023115.3后用順鉑進行誘導,檢測各個指標變化。在U251MG細胞系中采用以上方法檢測AC023115.3對細胞凋亡的影響。3.分別在U251MG細胞中過表達或在U87MG細胞中敲低AC023115.3后進行順鉑誘導,用熒光圖像觀察和分析細胞中LC3點狀形成狀態(tài),使用Western blot檢測細胞中LC3-Ⅱ型蛋白相對于I型蛋白的比例變化,以及p62蛋白表達量的變化,并用透射電鏡觀察和分析細胞中自噬小體的數(shù)量變化,以明確AC023115.3對自噬的調(diào)控作用。4.使用靶向自噬相關基因5(atg5)的shrna分別轉(zhuǎn)染u87mg和u251mg細胞后用同等劑量的順鉑進行誘導,隨后使用westernblot技術檢測自噬及細胞凋亡相關蛋白表達量的變化,同時采用mtt方法評估細胞的生存能力。使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-ma)對u87mg和u251mg細胞后處理后進行順鉑誘導,檢測自噬和凋亡相關蛋白表達量的變化,以及細胞生存能力的變化。在u87mg細胞中用共轉(zhuǎn)染ac023115.3的sirna和atg5的shrna后,檢測順鉑誘導的細胞凋亡的變化,明確ac023115.3引起的順鉑誘導的細胞凋亡的改變與自噬的關系,同時并使用3-ma進行驗證。5.對u87mg和u251mg細胞進行順鉑誘導后使用westernblot檢測bcl2家族蛋白表達量的變化,對ac023115.3敲低的u87mg細胞進行順鉑誘導,使用westernblot方法檢測mcl1蛋白表達量的變化,用qpcr和rt-pcr檢測u87mg細胞中ac023115.3對mcl1mrna表達水平的影響。使用蛋白半衰期實驗和泛素化實驗檢測ac023115.3對mcl1蛋白水平的影響。使用westernblot檢測ac023115.3對于mcl1磷酸化水平的影響(ser159位點)。對u87mg和u251mg細胞進行順鉑誘導后使用westernblot檢測gsk3β蛋白表達量的變化,隨后在u251mg細胞中過表達或在u87mg細胞中敲低ac023115.3后檢測gsk3β蛋白表達量的變化。在u87mg細胞中敲低ac023115.3同時過表達gsk3β、在u251mg細胞中過表達ac023115.3同時敲低gsk3β,隨后進行順鉑誘導,使用westernblot檢測mcl1蛋白表達量的變化。通過以上幾方面的實驗明確ac023115.3、gsk3β、mcl1之間的調(diào)控關系。6.將u87mg細胞順鉑處理后利用qpcr檢測gsk3βmrna表達水平的變化。將敲低ac023115.3的u87mg細胞進行順鉑誘導,qpcr檢測gsk3βmrna表達水平的變化。利用rip實驗檢測ago2抗體與ac023115.3結(jié)合情況,判斷ac023115.3是否與微小rna(mirna)結(jié)合,運用lncipedia數(shù)據(jù)庫預測ac023115.3結(jié)合的mirnas。對可能性最大的mir-26a利用報告基因?qū)嶒炦M行驗證。將ac023115.3序列、含有mir-26a結(jié)合位點的gsk3β3'utr(非編碼區(qū))序列、以及ac023115.3的突變序列分別構(gòu)建到報告基因載體中,驗證mir-26a與ac023115.3是否結(jié)合。隨后在u87mg和u251細胞中轉(zhuǎn)染含有gsk3β-3'utr序列的載體,順鉑誘導后檢測相對熒光素酶活性。在u87mg細胞中轉(zhuǎn)染含有gsk3β3'utr序列的載體,同時敲低ac023115.3或過表達mir-26a后進行順鉑誘導,檢測相對熒光素酶活性,使用westernblot檢測gsk3β蛋白水平變化。通過在u87mg和u251mg細胞中共轉(zhuǎn)染gsk3β3'utr、mir-26a、ac023115.3進行報告基因?qū)嶒?闡明ac023115.3、mir-26a和gsk3β三者之間的關系。7.在u87mg中共轉(zhuǎn)染外源性ac023115.3和帶有flag標簽的mcl1后進行順鉑誘導,使用westernblot檢測凋亡及自噬相關蛋白表達量的變化。隨后在過表達ac023115.3的u251mg細胞中敲低gsk3β,檢測凋亡及自噬相關蛋白表達量的變化。將mir-26a抑制劑或mir-26a模擬物導入u87mg細胞,順鉑誘導后檢測凋亡及自噬相關蛋白表達量的變化。在導入有mir-26a抑制劑或mir-26a模擬物的u87mg細胞中過表達gsk3β后進行順鉑誘導,westernblot檢測凋亡及自噬相關蛋白表達量的變化。在u87mg細胞中敲低ac023115.3,同時導入mir-26a抑制劑,順鉑誘導后檢測凋亡及自噬相關蛋白表達量的變化。在過表達ac023115.3的u87mg細胞中導入mir-26模擬物,順鉑誘導后westernblot檢測凋亡及自噬相關蛋白表達量的變化。通過以上幾方面的實驗,闡明ac023115.3的生物學功能與mir-26a-gsk3β-mcl1信號通路的關系。結(jié)果:1.順鉑能促進膠質(zhì)瘤細胞的凋亡,基因芯片分析顯示順鉑引起的差異表達的lncrnas中ac023115.3的表達明顯上調(diào),且這種改變與藥物劑量或作用時間呈正相關。ac023115.3表達明顯上調(diào)可減弱膠質(zhì)瘤細胞順鉑的耐藥性。2.westernblot及流式細胞術檢測結(jié)果顯示,在膠質(zhì)瘤細胞中ac023115.3的表達下調(diào)使凋亡相關蛋白的表達降低,凋亡細胞數(shù)減少;與此相反,上調(diào)ac023115.3的表達可增強凋亡相關蛋白的表達,凋亡細胞數(shù)增多。ac023115.3促進順鉑誘導的細胞凋亡。3.細胞熒光實驗、westernblot、透射電鏡超微結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果均表明,膠質(zhì)瘤細胞中ac023115.3表達上調(diào)能降低自噬相關關鍵分子的表達。相反,ac023115.3表達下調(diào)能增強自噬相關的關鍵分子的表達。ac023115.3在順鉑誘導下能夠抑制自噬。4.使用自噬相關基因5(atg5)的shrna或自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-ma)處理膠質(zhì)瘤細胞后,順鉑誘導細胞凋亡的能力相對增強,細胞生存力下降。在膠質(zhì)瘤細胞中,由敲低ac023115.3引起的順鉑誘導的凋亡率的下調(diào)可被atg5的敲低或3-ma的使用所逆轉(zhuǎn)。ac023115.3通過抑制自噬來增強順鉑誘導的細胞凋亡。5.westernblot結(jié)果顯示:膠質(zhì)瘤細胞用順鉑處理后mcl1的蛋白表達下調(diào),敲低ac023115.3可抑制對mcl1表達的下調(diào)作用,提高了mcl1蛋白的穩(wěn)定性,使順鉑誘導的mcl1的泛素化水平的增強作用被抑制。順鉑可促使mcl1蛋白的磷酸化水平發(fā)生變化并可增強gsk3β的表達,gsk3β的表達受ac023115.3正向調(diào)控。利用共轉(zhuǎn)染的方法證實了膠質(zhì)瘤細胞中ac023115.3通過gsk3β下調(diào)mcl1的表達。6.ac023115.3對順鉑處理后膠質(zhì)瘤細胞中的gsk3βmrna表達水平無影響。rna免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示ac023115.3可能與mirna發(fā)生結(jié)合。并通過lncipedia預測和用報告基因?qū)嶒灪Y選出可能性最大的mirna(mir-26a)。運用報告基因?qū)嶒炓约肮厕D(zhuǎn)染的方法證明gsk3β、mir-26a、ac023115.3三者之間存在以下關系,即ac02115.3扮演著mir-26a吸附海綿的角色并促進gsk3β的表達。7.ac023115.3表達上調(diào)可以促進膠質(zhì)瘤細胞中順鉑誘導的凋亡并且降低自噬,但這種作用可被mcl1抑制。gsk3β的下調(diào)可抑制ac023115.3所產(chǎn)生的增強凋亡的作用,并能促進自噬。mir-26a抑制劑可增強順鉑誘導的細胞凋亡并減弱自噬,外源性增加mir-26a表達水平可以減弱細胞凋亡并促進自噬;過表達gsk3β可消除mir-26a所發(fā)揮的這些作用。mir-26a在順鉑誘導的細胞凋亡和自噬中發(fā)揮的生物學功能依賴于gsk3β的表達。8.敲低ac023115.3能抑制順鉑誘導的細胞凋亡并促進自噬;mir-26a抑制劑可消除這些作用。相比之下,增強mir-26a的表達后可削弱ac023115.3過表達所引起的細胞凋亡。綜合以上結(jié)果,ac023115.3可通過調(diào)控mir-26a-gsk3β-mcl1通路來增強順鉑誘導的細胞凋亡并抑制自噬。結(jié)論:1.ac023115.3可被順鉑誘導并抑制膠質(zhì)瘤的化療耐藥性。2.ac023115.3可通過減弱mcl1介導的自噬來促進順鉑誘導的膠質(zhì)瘤細胞的凋亡。3.ac023115.3扮演著mir-26asponge的角色并抑制其活性。4.AC023115.3通過調(diào)控miR-26a-GSK3β-MCL1信號通路增強順鉑誘導的凋亡,提高膠質(zhì)瘤細胞的化療敏感性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.41

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