發(fā)布時間：2018-02-11 06:54

  本文關(guān)鍵詞： 人膠質(zhì)瘤細胞 長鏈非編碼RNA GAS5 微小RNA　出處：《重慶醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景:神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤。其中,惡性膠質(zhì)瘤超過了50%,絕大部分膠質(zhì)瘤生長迅速并具有高度的侵襲性。外科手術(shù)和放化療等傳統(tǒng)治療方法有其自身的局限。過去的幾十年,人們在基因和免疫治療上有所進展,但也沒能顯著提高病人的總體生存率。因此,迫切需要找到膠質(zhì)瘤形成和發(fā)展中的關(guān)鍵分子,以便為膠質(zhì)瘤的治療提供新的靶點。資料顯示,人類有超過90%以上的轉(zhuǎn)錄后的RNA為非編碼RNA,其長度大于200nt的非編碼RNA被定義為長非編碼RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)。近年來的研究發(fā)現(xiàn),lnc RNA具有的多種細胞生物學功能,這些功能將對細胞生物學行為產(chǎn)生重大影響。眾多資料顯示,lnc RNA可以作為癌基因或抑癌基因在腫瘤細胞的增殖,遷移和侵襲過程中發(fā)揮作用。lnc RNA主要通過在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平對影響腫瘤細胞生物學行為的基因表達進行調(diào)控,從而改變腫瘤細胞的生物學行為。近年來的研究發(fā)現(xiàn),lnc RNA可以通過調(diào)控micro RNA,從而影響下游信號通路。本課題組于前期研究中,篩選出在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中可能發(fā)揮重要作用的長非編碼RNA GAS5。本課題就GAS5對人膠質(zhì)瘤細胞生長,遷移和侵襲能力的影響及機制進行探討。目的:探討GAS5對人膠質(zhì)瘤細胞U251和U87細胞增殖、周期、侵襲和遷移的影響及其機制。方法:1.過表達或敲低GAS5后,采用MTS實驗、流式細胞儀、劃痕實驗、transwell小室遷移和侵襲實驗以及裸鼠皮下成瘤實驗研究GAS5在人膠質(zhì)瘤細胞中的功能。2.采用生物信息學技術(shù)預測可能與GAS5相互作用的micro RNA。3.采用實時定量PCR(QRT-PCR)驗證生物信息學預測的micro RNA,確認出真正能被GAS5下調(diào)的靶micro RNA。4.為了證實靶micro RNA也能下調(diào)GAS5的表達,通過轉(zhuǎn)染mi R-18a-5p mimics和inhibitor使靶micro RNA在U251細胞中過表達或敲低后,檢測GAS5的表達變化。5.應用原位雜交(In situ Hybridization,ISH)在組織芯片(包括膠質(zhì)瘤和正常腦組織)中檢測GAS5和靶micro RNA表達的關(guān)系。6.生物信息學技術(shù)預測靶micro RNA與GAS5相互作用的結(jié)合位點并進一步驗證。7.過表達GAS5后,QRTPCR檢測靶micro RNA前體(Pre-mi RNA)和原始靶micro RNA(pri-mi RNA)的表達。8.RNA沉淀方法檢測GAS5與靶micro RNA的相互作用是否需要RISC的參與。9.探討GAS5作用于人膠質(zhì)瘤細胞的信號通路。在膠質(zhì)瘤細胞中過表達GAS5后,Western blot檢測靶micro RNA的下游靶基因的表達變化。結(jié)果:1.過表達GAS5后,U251和U87細胞的增殖能力,遷移和侵襲能力明顯減弱。敲低GAS5的表達后,U251和U87細胞的增殖能力,遷移和侵襲能力增加。與對照組相比,GAS5明顯抑制裸鼠體內(nèi)的腫瘤生長。2.生物信息學技術(shù)預測可能與GAS5相互作用的micro RNA共有46個。3.QRTPCR驗證46 micro RNA后發(fā)現(xiàn),過表達GAS5能降低mi R-18a-5p的表達水平,同時,敲低GAS5能增加mi R-18a-5p的表達;4.過表達mi R-18a-5p能降低GAS5的表達,敲低mi R-18a-5p后增加了GAS5的表達。5.原位雜交結(jié)果顯示,在正常腦組織中,GAS5的表達上調(diào),mi R-18a-5p的表達下調(diào),而在膠質(zhì)瘤組織中,GAS5的表達下調(diào),mi R-18a-5p的表達上調(diào)。6.生物信息學技術(shù)預測出GAS5和mi R-18a-5p之間的一個結(jié)合位點。將結(jié)合位點刪除后的GAS5(d-GAS5)不能降低mi R-18a-5p的表達,MTS結(jié)果顯示,相對于GAS5對U251細胞增殖的抑制程度而言,d-GAS5對U251細胞增殖的抑制減弱。7.過表達GAS5后,pri-mir-18a-5p和pre-mir-18a-5p的表達無變化,提示GAS5對mi R-18a-5p是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。8.RNA沉淀方法證實GAS5與mi R-18a-5p之間相互作用需要RISC的參與。9.過表達GAS5后,mi R-18a-5p的靶基因Neogenin的表達增加。結(jié)論:1、GAS5可顯著抑制人膠質(zhì)瘤細胞體外增殖、遷移和侵襲能力;2、GAS5與mi R-18a-5p通過互補結(jié)合位點直接結(jié)合,相互降低對方的表達水平,此過程需要RISC的參與;3.GAS5在膠質(zhì)瘤中通過降低mi R-18a-5p的表達,進而影響到mi R-18a-5p的下游靶基因Neogenin的表達,從而發(fā)揮抑癌基因的功能。
[Abstract]:Background : Gliomas are the most common primary intracranial tumors . Among them , malignant glioma is more than 50 % . Most of the gliomas grow rapidly and have a high degree of invasion . In the past few decades , there has been an urgent need to find key elements in the formation and development of glioma , so as to provide a new target for the treatment of glioma . In recent years , it has been found that the expression of GAS5 and target micro RNA in human glioma cells can be regulated by means of real - time quantitative PCR ( QRT - PCR ) . 5 . The results showed that the expression of miR - 18a - 5p decreased and the expression of miR - 18a - 5p decreased .

【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

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本文編號：1502457