發(fā)布時間：2018-02-10 10:29

  本文關(guān)鍵詞： 消化道腫瘤 肝癌 乙肝病毒X蛋白 NK細(xì)胞 PD-1　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：消化道腫瘤是指起源于消化道及其附屬器官的腫瘤,包括食管癌、胃癌、肝癌等。多種消化道腫瘤的發(fā)生發(fā)展都與病原體感染及其所引起的慢性炎癥相關(guān),例如,乙肝相關(guān)性肝癌,幽門螺旋桿菌感染相關(guān)性胃癌等。所以針對消化道腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究一方面致力于研究病原體對促進(jìn)消化道腫瘤發(fā)生發(fā)展的直接作用,希望揭示病原體的致癌機(jī)制并進(jìn)行干預(yù);另一方面,病原體感染引起炎癥,炎癥與腫瘤的關(guān)系日益引起研究者的重視。慢性炎癥是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和進(jìn)展確切的因素之一。和不同類型消化道腫瘤發(fā)病相關(guān)的病原體不同,但它們的共同特點是可以持續(xù)介導(dǎo)炎癥。大量免疫細(xì)胞被募集到病灶中,在各種因素的共同作用下經(jīng)歷免疫失能,失去其抗病原體抗腫瘤的作用,甚至可促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。因此,研究者在關(guān)注病原體直接致癌的同時,從未忽視病原體引起的慢性炎癥改變對腫瘤的作用。乙肝病毒感染是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的最為明確導(dǎo)致肝癌的高危因素之一,我們選擇了乙肝病毒相關(guān)性肝癌為代表,希望揭示病原體對誘導(dǎo)機(jī)體正常組織癌變的可能機(jī)制。大量已發(fā)表的研究證實,乙肝病毒的多種病毒成分在體外可促進(jìn)肝癌細(xì)胞系的增殖和遷移,提示乙肝病毒自身的病毒蛋白和復(fù)制過程直接促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展,但是機(jī)制不甚明了。這是本研究第一部分主要關(guān)注的內(nèi)容。本研究第二部分著重關(guān)注包括肝癌在內(nèi)的多種消化道腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,炎癥微環(huán)境在其中發(fā)揮的作用。在慢性炎癥發(fā)展過程中,多種免疫細(xì)胞被募集至區(qū)域微環(huán)境中,逐步被馴化,并最終有利于腫瘤的發(fā)生。腫瘤馴化導(dǎo)致的免疫細(xì)胞失能已經(jīng)被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展最重要的機(jī)制之一。因此本研究從病原體自身和炎癥微環(huán)境兩方面入手,揭示包括肝癌在內(nèi)的多種消化道腫瘤的發(fā)病機(jī)制,希望找到合適的藥物靶點,研發(fā)新藥物,促進(jìn)消化道腫瘤的治療。第一部分:乙肝病毒X蛋白通過下調(diào)磷酶PPM1a過度激活TGF-β信號通路促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)簡稱乙肝病毒,屬嗜肝DNA病毒,肝細(xì)胞表面有其受體,因此其感染人體后主要的靶器官是肝臟,在肝細(xì)胞中繁殖、復(fù)制、利用肝細(xì)胞中的細(xì)胞器表達(dá)病毒蛋白,破壞肝細(xì)胞,引起肝臟炎癥。病毒基因組可全部或部分整合入肝細(xì)胞染色體中,或是合成cccDNA與細(xì)胞內(nèi)組蛋白結(jié)合后形成病毒的微小染色體,不易被清除�，F(xiàn)在已經(jīng)明確,HBV感染是肝癌的最重要危險因素之一,在中國,90%以上的肝癌患者都有HBV感染背景。中國是乙肝大國,據(jù)統(tǒng)計,現(xiàn)階段中國攜帶乙肝病毒的人數(shù)可達(dá)2億,相當(dāng)于每7個人中就有1位是乙肝病毒攜帶者。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈提示了關(guān)注乙肝病毒及其致癌機(jī)制是中國科學(xué)家們不可推卸又任重道遠(yuǎn)的責(zé)任。本課題組長期致力于研究HBV及其病毒蛋白致肝癌的機(jī)制。大量研究已經(jīng)證實,乙肝病毒X蛋白(Hepatitis BX protein,HBx)在促進(jìn)病毒復(fù)制以及誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌變方面發(fā)揮了重要作用,是一個臭名昭著的癌蛋白。但是其促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制仍然不清楚,未找到很好的藥物靶點來干預(yù)這一過程。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)HBx可以通過促進(jìn)磷酸酶PPM1a的泛素化降解下調(diào)PPM1a,使磷酸化相關(guān)信號通路TGF-β信號通路中的活化的信使分子pSmad2/3不能被及時的去磷酸化失活,導(dǎo)致TGF-β信號通路過度激活,該信號通路能明顯促進(jìn)肝癌的遷移與侵襲。以下是我們的研究成果。(1)TGF-β信號通路被激活時,HBx可以明顯降低細(xì)胞內(nèi)PPM1a的蛋白水平:我們在兩種肝癌細(xì)胞系HepG2及Bel-7402中分別轉(zhuǎn)染HBx的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-HBx-HA及其對照質(zhì)粒pcDNA3,然后給予細(xì)胞TGF-β細(xì)胞因子刺激激活TGF-β信號通路,Western Blot檢測蛋白水平。結(jié)果顯示HBx明顯降低細(xì)胞內(nèi)PPM1a的蛋白含量,過度激活TGF-β信號通路。并且,HBx對PPM1a的抑制作用具有時間和劑量依賴性。(2)HBx和TGF-β在促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移上有協(xié)同作用:我們向HepG2和Bel-7402細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染pcDNA-HBx-HA或者pcDNA3,12h后給予細(xì)胞持續(xù)TGF-β刺激或不刺激。Tranwell小室實驗檢測4組細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染了 HBx不加TGF-β刺激和轉(zhuǎn)染了空載體但是加入TGF-β刺激的細(xì)胞遷移能力均強(qiáng)于轉(zhuǎn)染.了空載體不加刺激的細(xì)胞,證實HBx和TGF-β可以促進(jìn)細(xì)胞遷移,但是轉(zhuǎn)染了HBx同時加入TGF-β刺激的細(xì)胞遷移能力明顯強(qiáng)于單一轉(zhuǎn)染HBx的細(xì)胞或者是單一加入TGF-β刺激的細(xì)胞,提示HBx和TGF-信號通路在促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移上具有明顯協(xié)同作用。兩種細(xì)胞系中的結(jié)果一致。(3)PPM1a質(zhì)粒拯救實驗可以削弱HBx對肝癌細(xì)胞的促遷移能力:下一步我們外源轉(zhuǎn)入PPM1a的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-PPM1a-Flag抵消HBx對PPMla的抑制,Transwell小室遷移與侵襲實驗檢測細(xì)胞運動能力的變化。結(jié)果表明:和單純轉(zhuǎn)染2ug的pcDNA3空載體的對照組細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染lug HBx表達(dá)質(zhì)粒和lug pcDNA3的細(xì)胞遷移侵襲能力增強(qiáng),但是轉(zhuǎn)染lug HBx表達(dá)質(zhì)粒的同時轉(zhuǎn)染lug PPM1a的表達(dá)質(zhì)粒,可以觀察到HBx對肝癌細(xì)胞的促遷移侵襲能力消失,提示HBx通過抑制PPM1a促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲。(4)HBx通過促進(jìn)PPM1a的泛素化降解實現(xiàn)對PPM1a的抑制:RT-PCR和Realtime PCR的結(jié)果都顯示HBx不影響PPM1a的mRNA水平,提示HBx對PPM1a的抑制作用是轉(zhuǎn)錄后水平。Western Blot的結(jié)果提示在細(xì)胞中加入蛋白酶體抑制劑MG-132后HBx對PPM1a的抑制作用消失,提示HBx對PPM1a的下調(diào)依賴蛋白酶體途徑。免疫共沉淀實驗的結(jié)果表明,在TGF-β信號通路活化的狀態(tài)下,HBx可以明顯增強(qiáng)PPM1a的泛素化水平。以上結(jié)果共同證實了 HBx通過增加PPM1a的泛素化-蛋白酶體降解途徑下調(diào)PPM1a的蛋白水平。(5)肝癌組織芯片免疫組化證實HBx在體內(nèi)對PPM1a的抑制:同一批患者的3套肝癌組織芯片分別做免疫組化檢測HBx、PPM1a和pSmad3的表達(dá)。首先,可以觀察到PPPM1a與pSmad3表達(dá)成負(fù)相關(guān),提示PPM1a在體內(nèi)可以特異性終止TGF-β信號通路;其次,PPM1a在腫瘤組織中表達(dá)明顯低于癌旁,提示PPM1a是一種抑癌蛋白。最重要的是,在肝癌組織芯片中觀測到PPM1a與HBx的表達(dá)成明顯負(fù)相關(guān)系,提示在體內(nèi)HBx下調(diào)PPM1a。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)了乙肝病毒HBV誘導(dǎo)肝癌的新的分子機(jī)制,即病毒蛋白HBx通過促進(jìn)磷酸酶PPM1a的降解過度激活TGF-β信號通路,進(jìn)而促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移。我們的研究結(jié)果為肝癌的治療提供了新的可行的藥物靶點,有望促進(jìn)肝癌的靶向治療。第二部分:PD-1通過抑制NK細(xì)胞的抗腫瘤免疫導(dǎo)致消化道腫瘤患者不良預(yù)后消化道腫瘤惡性程度高,對現(xiàn)有治療方法不敏感,嚴(yán)重危害了人類的健康,研究消化道腫瘤的發(fā)病機(jī)制并尋找相關(guān)藥物靶點尤為重要。消化道腫瘤是炎癥相關(guān)腫瘤,隨著腫瘤的發(fā)生發(fā)展,T淋巴細(xì)胞,NK細(xì)胞等大量免疫細(xì)胞浸潤進(jìn)入腫瘤微環(huán)境中。研究發(fā)現(xiàn),這些免疫細(xì)胞已經(jīng)喪失其對腫瘤細(xì)胞的殺傷功能,是一群功能受損的免疫細(xì)胞,研究免疫細(xì)胞功能受損的機(jī)制并恢復(fù)其對腫瘤的殺傷作用具有重要意義。PD-1是近年來發(fā)現(xiàn)的新型免疫檢查點分子,腫瘤微環(huán)境內(nèi)T細(xì)胞表面高表達(dá)PD-1,腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)其配體PD-L1,PD-L1與PD-1結(jié)合后能抑制T細(xì)胞的活化。阻斷PD-1和PD-L1的結(jié)合可以恢復(fù)T細(xì)胞功能,促進(jìn)T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷。多種靶向PD-1/PD-L1的阻斷性抗體已經(jīng)被研發(fā)出來并在臨床上取得了良好的治療效果。NK細(xì)胞是固有免疫的重要組成部分,可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞。同T細(xì)胞類似,消化道腫瘤患者體內(nèi)NK細(xì)胞的功能也是受到抑制的,但是機(jī)制不甚明了。研究發(fā)現(xiàn),健康人體內(nèi)NK細(xì)胞表面基本沒有PD-1表達(dá),但是在一些感染相關(guān)疾病中NK上PD-1是高表達(dá)的,提示PD-1可能參與NK細(xì)胞功能調(diào)控,但是在腫瘤模型中的研究依然不足。本研究主要在消化道腫瘤模型中探索PD-1是否調(diào)控NK細(xì)胞腫瘤殺傷功能,并取得了以下研究成果。(1)NK細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)與臨床消化道腫瘤患者預(yù)后的關(guān)系:流式細(xì)胞術(shù)檢測消化道腫瘤患者外周血NK細(xì)胞上PD-1的表達(dá)水平并分析其與預(yù)后的關(guān)系。和健康人相比,消化道腫瘤患者外周血NK表面PD-1表達(dá)升高,且NK上PD-1表達(dá)越高提示患者腫瘤分化程度越低、TNM分級越差同時存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)檢測消化道腫瘤患者腫瘤浸潤NK細(xì)胞上PD-1的表達(dá)情況并分析其與患者生存期之間的關(guān)系,肝癌患者的腫瘤浸潤NK細(xì)胞上PD-1表達(dá)較癌旁高,且腫瘤浸潤NK細(xì)胞上PD-1表達(dá)水平越高,患者生存期越短(2)PD-1對NK細(xì)胞抗腫瘤免疫功能的調(diào)控:流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)與細(xì)胞表面抑制性標(biāo)志和活化性標(biāo)志的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)PD-1+NK細(xì)胞傾向于表達(dá)較高水平的NKG2D和較低水平的NKG2A。同時給予NK細(xì)胞細(xì)胞因子等活化性刺激,發(fā)現(xiàn)PD-1的表達(dá)隨著刺激時間逐步升高,和PD-1-NK細(xì)胞相比,PD-1+ NK細(xì)胞分泌IFN-y的能力更強(qiáng),和脫顆粒相關(guān)的標(biāo)志CD107a的表達(dá)更高,這些結(jié)果共同提示PD-1表達(dá)在活化的NK細(xì)胞表面。利用抗體阻斷的方法研究PD-1對NK細(xì)胞功能的調(diào)控,在培養(yǎng)基中提前加入PD-1和PD-L1的阻斷性抗體封閉PD-1與PD-L1的結(jié)合,發(fā)現(xiàn)可增強(qiáng)NK細(xì)胞的功能,提示PD-1抑制了 NK細(xì)胞的功能。(3)PD-1和其配體PD-L1結(jié)合后調(diào)控NK細(xì)胞凋亡:利用Annexin-V標(biāo)記凋亡細(xì)胞并用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡比率,發(fā)現(xiàn)本底狀態(tài)下PD-1+NK細(xì)胞更容易凋亡。在培養(yǎng)板底部包被PD-1的抗體,與NK細(xì)胞表面的PD-1交聯(lián)激活PD-1,然后給予細(xì)胞活化性刺激,發(fā)現(xiàn)PD-1激活后可以明顯促進(jìn)PD-1+NK細(xì)胞的凋亡,對PD-1-NK細(xì)胞凋亡無影響。在培養(yǎng)基中提前加入PD-L1的阻斷性抗體封閉PD-1的激活,然后給予細(xì)胞活化性刺激誘導(dǎo)凋亡,發(fā)現(xiàn)PD-L1阻斷性抗體可以明顯抑制PD-1+NK細(xì)胞的凋亡,而對PD-1-NK細(xì)胞的凋亡無影響。以上結(jié)果共同證實激活NK細(xì)胞表面的PD-1可以促進(jìn)NK細(xì)胞的凋亡。(4)Western Blot的方法研究PD-1參與NK功能調(diào)控的機(jī)制:利用人NK細(xì)胞系NK92細(xì)胞研究PD-1參與調(diào)控NK功能的下游信號通路。在NK92細(xì)胞的培養(yǎng)基中提前加入PD-1或者PD-L1的阻斷性抗體封閉PD-1與PD-L1的結(jié)合,然后給予NK92活化性刺激或者是腫瘤細(xì)胞刺激,Western Blot檢測NK92細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路的激活情況,結(jié)果顯示封閉PD-1/PD-L1后,NK92細(xì)胞中AKT總量不變,但是磷酸化水平明顯增強(qiáng),提示PD-1與其配體PD-L1結(jié)合后,通過抑制其下游PI3K/AKT信號通路實現(xiàn)對NK細(xì)胞功能的抑制。(5)利用荷瘤動物模型體內(nèi)驗證體外實驗的結(jié)果:給予荷瘤裸鼠腹腔注射PD-1阻斷性抗體,可以抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長,同時發(fā)現(xiàn)此時小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞活性增強(qiáng)。敲除裸鼠體內(nèi)NK細(xì)胞,PD-1阻斷性抗體對腫瘤抑制的作用消失,提示PD-1阻斷性抗體是通過提高NK功能發(fā)揮其腫瘤治療作用。本研究首次從臨床和基礎(chǔ)兩方面證實了 PD-1在腫瘤模型中對NK細(xì)胞功能的調(diào)控。已發(fā)表的研究證實多種消化道腫瘤高表達(dá)PD-L1,以及PD-1參與調(diào)節(jié)消化道腫瘤免疫微環(huán)境中T細(xì)胞耗竭,我們的研究結(jié)果補(bǔ)充了 PD-1對消化道腫瘤患者機(jī)體固有免疫的調(diào)節(jié),進(jìn)一步提示了靶向于PD-1/PD-L1免疫檢查點的免疫治療應(yīng)用于消化道腫瘤患者的可行性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1500305