本文關(guān)鍵詞： 急性髓系白血病 淋巴細(xì)胞特異連接蛋白 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化蛋白3 THP-1細(xì)胞 基因沉默 急性髓系白血病 青蒿琥酯 THP-1細(xì)胞 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化蛋白3　出處：《遵義醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一類非常常見(jiàn)的造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病,其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,具有高度異質(zhì)性,總體預(yù)后不佳。LNK基因主要表達(dá)在造血細(xì)胞和組織上,在維持正常造血穩(wěn)定的過(guò)程中有著不可替代的作用,參與了JAK/STAT(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription)等多條信號(hào)通路的調(diào)控。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化蛋白3(signal transducerand activator of transcription 3,STAT3)是JAK/STAT信號(hào)通路中LNK基因的下游基因,是公認(rèn)的致癌轉(zhuǎn)錄因子,參與了多種癌癥和白血病的發(fā)生發(fā)展。本研究旨在了解急性髓系白血病患者中LNK基因、STAT3基因表達(dá)情況;探討LNK基因沉默后對(duì)人急性單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞增殖的影響及對(duì)其下游基因STAT3的影響。方法:選取2015年1月--2016年1月間在我院初診的AML患者30例為病例組,同期住院的非惡性疾病患者20例為對(duì)照組,分別收集骨髓2ml。提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄為c DNA,設(shè)計(jì)LNK、STAT3基因引物,采用RT-PCR檢測(cè)病例組和對(duì)照組LNK m RNA、STAT3 m RNA表達(dá)情況;提取蛋白,采用Western Blotting檢測(cè)LNK、STAT3蛋白表達(dá)情況。培養(yǎng)THP-1細(xì)胞,以慢病毒為載體介導(dǎo)si RNA穩(wěn)定沉默LNK基因;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染率;RT-PCR驗(yàn)證LNK沉默效應(yīng);CCK-8法檢測(cè)THP-1細(xì)胞增殖情況;Western Blotting檢測(cè)LNK、STAT3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:RT-PCR結(jié)果顯示,AML患者的LNK m RNA和STAT3 m RNA水平較對(duì)照組均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Western Blotting結(jié)果顯示,AML患者的LNK和STAT3蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P0.05),說(shuō)明AML患者存在LNK和STAT3基因的高表達(dá)。LNK si RNA-EGFP重組慢病毒感染THP-1細(xì)胞的最佳MOI=100,在感染72小時(shí)時(shí)綠色熒光蛋白表達(dá)最強(qiáng);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組感染效率均在95%以上,說(shuō)明慢病毒感染THP-1細(xì)胞成功;RT-PCR檢測(cè)各組LNK m RNA表達(dá)情況,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,空病毒組無(wú)明顯改變(P0.05),各感染組LNK m RNA均顯著下降(P0.05),提示LNK基因沉默成功;采用CKK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況,與對(duì)照組相比,空病毒組細(xì)胞增殖無(wú)明顯改變(P0.05),感染組細(xì)胞增殖速率明顯下降(P0.05);Western Blotting結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,空病毒組LNK、STAT3蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變(P0.05),感染組則顯著下降(P0.01),沉默LNK后,LNK蛋白表達(dá)下降,同時(shí)伴有STAT3蛋白的下降,說(shuō)明在THP-1細(xì)胞中,LNK表達(dá)的下降影響STAT3基因的表達(dá),LNK基因?qū)TAT3表達(dá)可能有促進(jìn)作用。結(jié)論:1.AML患者中存在LNK、STAT3基因的高表達(dá);2.以慢病毒為載體,采用si RNA技術(shù)可以成功沉默THP-1細(xì)胞的LNK基因;3.LNK沉默后,THP-1細(xì)胞增殖明顯受阻,提示LNK基因可以促進(jìn)急性髓系白血病細(xì)胞的增殖;4.LNK沉默后,STAT3蛋白表達(dá)顯著下調(diào),提示LNK基因可能影響STAT3的表達(dá);目的:急性髓系白血病(AML)是一類惡性程度較高的血液腫瘤,目前的治療主要以化療為主。近年來(lái),隨著對(duì)急性髓系白血病發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入,各種聯(lián)合化療方案和支持治療的日益完善,急性髓系白血病的預(yù)后有所改觀。但是,化療藥物的多重耐藥性、副作用等一系列問(wèn)題,使得當(dāng)前急性髓系白血病的治療依然存在較大的困難,為此迫切需要尋找新的安全高效、少耐藥、不良反應(yīng)輕微的藥物。青蒿琥酯(Artesunate,ART)是青蒿素的一種半合成衍生物,已在臨床應(yīng)用20余年,具有水溶性好,抗瘧療效高、安全性高等特點(diǎn)。近年研究表明,青蒿琥酯對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抗癌作用。本研究旨在探討青蒿琥酯對(duì)急性髓系白血病是否具有抗白血病作用及其作用機(jī)制,為急性髓系白血病的治療尋找新的藥物。方法:培養(yǎng)THP-1細(xì)胞,選用5種濃度的青蒿琥酯處理THP-1細(xì)胞后,采用CCK-8法檢測(cè)THP-1細(xì)胞的活力,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,Western Blotting檢測(cè)STAT3、caspase3、caspase8蛋白表達(dá)。將5周齡裸鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組頸部皮下注射對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1細(xì)胞1.5′106個(gè)/只,對(duì)照組頸部皮下注射PBS 0.1ml/只;待裸鼠皮下成瘤后,藥物干預(yù)組腹腔注射不同濃度青蒿琥酯,生理鹽水組腹腔注射等量生理鹽水,觀察瘤體的變化;待青蒿琥酯治療結(jié)束1周后,處死裸鼠,取瘤體組織提取蛋白,Western Blotting法檢測(cè)STAT3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:青蒿琥酯能明顯抑制體外THP-1細(xì)胞的增殖,其效應(yīng)呈劑量及時(shí)間依賴性;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示青蒿琥酯能增加THP-1細(xì)胞的凋亡;Western Blotting結(jié)果顯示,青蒿琥酯顯著下調(diào)STAT3蛋白表達(dá),同時(shí)激活capase3和caspase8從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;實(shí)驗(yàn)組裸鼠接種THP-1細(xì)胞后4周皮下成瘤;與生理鹽水組相比,腹腔注射青蒿琥酯能顯著抑制瘤體的生長(zhǎng),且沒(méi)有明顯的不良反應(yīng)。瘤體組織Western Blotting結(jié)果顯示,青蒿琥酯下調(diào)了STAT3蛋白表達(dá)(P0.05)。結(jié)論:1.青蒿琥酯能夠顯著抑制THP-1細(xì)胞的增殖,提示青蒿琥酯對(duì)AML有抗白血病作用;2.青蒿琥酯作用于THP-1細(xì)胞后,STAT3蛋白表達(dá)下降,凋亡蛋白caspase3和caspase8表達(dá)上調(diào),提示青蒿琥酯可能是通過(guò)下調(diào)STAT3基因的表達(dá)和激活caspase3和caspase8從而發(fā)揮抗白血病作用。3.THP-1細(xì)胞能在裸鼠皮下成瘤,青蒿琥酯腹腔注射有效抑制瘤體的生長(zhǎng),提示ART對(duì)THP-1細(xì)胞在體內(nèi)亦有抗白血病作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R733.71

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本文編號(hào)：1493302