本文關(guān)鍵詞： 非小細(xì)胞肺癌 骨膜蛋白 順鉑 化療耐藥 Stat3信號通路　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:骨膜蛋白(periostin,POSTN)也被稱為成骨細(xì)胞特異性因子-2(osteoblast-specific factor 2,OSF-2),是由成骨細(xì)胞分泌的一種多功能胞外基質(zhì)蛋白。據(jù)文獻(xiàn)報道其在胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌等多種不同類型的腫瘤中高表達(dá),并由此成為惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的候選基因之一。研究顯示骨膜蛋白的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer NSCLC)的不良預(yù)后密切相關(guān)。此外骨膜蛋白還可影響腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性,卵巢癌及直腸癌基礎(chǔ)研究中表明骨膜蛋白可激活某些信號通路而導(dǎo)致化療耐藥。而骨膜蛋白與非小細(xì)胞肺癌順鉑(Cisplatin,CDDP)耐藥之間的關(guān)系及其可能的機(jī)制,至今尚未有學(xué)者探討和研究。基于此,本課題系統(tǒng)探討了骨膜蛋白在非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥中的作用及其相關(guān)的作用機(jī)制。第一部分,我們通過梯度增加順鉑給藥劑量,構(gòu)建了人非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥細(xì)胞株A549/CDDP;并分析耐藥細(xì)胞株A549/CDDP與親本細(xì)胞株A549中骨膜蛋白的表達(dá)情況。初步探討了骨膜蛋白的表達(dá)與人非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥之間的相關(guān)性。第二部分,通過構(gòu)建骨膜蛋白過表達(dá)載體,在體外研究了過表達(dá)骨膜蛋白對順鉑誘導(dǎo)的A549細(xì)胞部分生物學(xué)行為,如細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等的影響;同時研究了抑制凋亡的重要信號通路Stat3/survivin在其中發(fā)揮的作用,進(jìn)一步探討其可能涉及的作用機(jī)制。第三部分,首先在耐藥細(xì)胞株A549/CDDP上,通過沉默骨膜蛋白的表達(dá)觀察細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)行為的改變,探討沉默骨膜蛋白是否可以在體外逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥的發(fā)生及相關(guān)作用機(jī)制;然后通過建立裸鼠非小細(xì)胞肺癌異體移植瘤模型,在體內(nèi)進(jìn)一步探討沉默骨膜蛋白的表達(dá)對非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥的影響。第一部分骨膜蛋白與非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥的相關(guān)性分析目的:本研究的目的是通過梯度增加順鉑給藥劑量,構(gòu)建人非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥細(xì)胞株A549/CDDP;并分析耐藥細(xì)胞株A549/CDDP與親本細(xì)胞株A549中骨膜蛋白的表達(dá)情況。初步探討骨膜蛋白的表達(dá)與人非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥之間的相關(guān)性。方法:對體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞給予不同濃度的順鉑刺激,并通過MTT法計算其半數(shù)抑制率(IC50),然后采用梯度增加順鉑劑量的方法構(gòu)建A549的順鉑耐藥細(xì)胞株A549/CDDP。檢測不同濃度順鉑作用下A549細(xì)胞中骨膜蛋白的m RNA及蛋白表達(dá)情況;并比較兩株細(xì)胞中骨膜蛋白的m RNA及蛋白表達(dá)情況,研究骨膜蛋白與非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥的相關(guān)性。統(tǒng)計方法采用單因素方差分析檢驗(yàn)。結(jié)果:1采用梯度增加順鉑劑量的方法,最終獲得在20μM的含順鉑培養(yǎng)基中穩(wěn)定增長并持續(xù)增殖的細(xì)胞株,即為順鉑耐藥細(xì)胞株A549/CDDP。A549/CDDP及A549的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為25μM和10μM,A549/CDDP對順鉑的耐藥性明顯增加。2采用0~30μmol·L-1CDDP處理細(xì)胞48h后,檢測骨膜蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,隨著CDDP濃度的增加,骨膜蛋白的m RNA和蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)增多的趨勢。骨膜蛋白的表達(dá)水平與CDDP的濃度呈正相關(guān),差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P?0.01。3耐藥細(xì)胞株A549/CDDP中骨膜蛋白的m RNA表達(dá)水平是親本細(xì)胞株A549的6倍(P?0.05);且A549/CDDP中骨膜蛋白的蛋白表達(dá)水平是A549的5.1倍(P?0.05),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:1針對人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549,通過梯度增加順鉑給藥劑量,成功構(gòu)建了順鉑耐藥細(xì)胞株A549/CDDP。2通過對A549和A549/CDDP兩株細(xì)胞耐藥性和骨膜蛋白表達(dá)的分析,發(fā)現(xiàn)骨膜蛋白的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥之間呈正相關(guān)。第二部分骨膜蛋白對A549細(xì)胞部分生物學(xué)行為的影響及相關(guān)機(jī)制目的:分析骨膜蛋白對人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549的增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等一系列生物學(xué)行為的影響;并研究抑制凋亡的重要信號通路Stat3/survivin在其中發(fā)揮的作用,進(jìn)一步探討其可能涉及的作用機(jī)制。方法:1構(gòu)建骨膜蛋白過表達(dá)質(zhì)粒載體,將過表達(dá)載體通過瞬時轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞中,檢測其轉(zhuǎn)染效率。2采用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot方法檢測骨膜蛋白過表達(dá)對順鉑誘導(dǎo)的A549細(xì)胞生存率、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的影響,檢測Stat3/survivin信號通路的活性。3采用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法同時在A549細(xì)胞中過表達(dá)骨膜蛋白和沉默survivin,研究骨膜蛋白調(diào)控順鉑耐藥的可能作用機(jī)制。結(jié)果:1將構(gòu)建的骨膜蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞之后,可顯著提高骨膜蛋白的表達(dá)。2 MTT結(jié)果提示,同對照組相比,10~30μM CDDP刺激下骨膜蛋白過表達(dá)組細(xì)胞活力分別增加1.56±0.37、1.62±0.17、3.43±1.82倍(P0.05);說明外源性過表達(dá)骨膜蛋白可顯著增加A549細(xì)胞對順鉑的抵抗力。3流式細(xì)胞術(shù)DNA含量檢測細(xì)胞的周期分布。結(jié)果顯示:對照組、10μMCDDP處理組、CDDP+pc DNA3.1(+)vector處理組G0/G1期細(xì)胞數(shù)所占百分比分別為:50.04±3.27%,90.30±4.25%,88.2±3.78%,S期細(xì)胞所占百分比分別為:46.44±2.31%,8.69±2.79%,8.92±2.81%,轉(zhuǎn)染pc DNA3.1(+)vector對CDDP抑制的周期轉(zhuǎn)換未見明顯影響(P0.05);相對于CDDP處理組,CDDP+POSTN過表達(dá)組G0/G1期細(xì)胞所占百分比由90.3±4.25%降低到67.49±5.3%,與之對應(yīng)的S期細(xì)胞比例則由8.69±2.79%增加到28.84±2.11%(P0.05 vs CDDP)。4流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法定量分析A549細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):對照組、10μM CDDP處理組、CDDP+pc DNA3.1(+)vector處理組細(xì)胞早期凋亡率分別為:2.45±0.56%,26.32±2.21%,27.93±3.71%,細(xì)胞中晚期凋亡/壞死率分別為:2.57±0.46%,13.02±2.01%,12.33±2.35%;相對于CDDP處理組,CDDP+POSTN過表達(dá)組細(xì)胞早期凋亡率由26.32±2.21%降低到11.91±2.74%,細(xì)胞中晚期凋亡/壞死率則由13.02±2.01%降低到7.03±2.05%(P0.05vs CDDP),外源性過表達(dá)骨膜蛋白可顯著抑制CDDP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡。5 Western Blot檢測A549細(xì)胞Caspase-3的活化情況,結(jié)果顯示,10μM CDDP刺激細(xì)胞后,A549細(xì)胞激活型Caspase-3的表達(dá)量明顯增加,但是過表達(dá)POSTN轉(zhuǎn)染組則可明顯逆轉(zhuǎn)CDDP對Caspase-3的活化。6 A549細(xì)胞株過表達(dá)骨膜蛋白后,檢測Stat3/survivin信號通路活性的變化,結(jié)果顯示:同對照組相比,10μMCDDP處理48h可使A549細(xì)胞中Stat3的磷酸化水平降低到0.43±0.05倍,過表達(dá)骨膜蛋白之后,CDDP誘導(dǎo)的Stat3的磷酸化水平從0.43±0.05增加到0.87±0.09(P0.05vs.CDDP);10μM CDDP處理48h后,細(xì)胞中survivin的表達(dá)減少到0.38±0.03倍,過表達(dá)骨膜蛋白后,CDDP誘導(dǎo)的survivin的表達(dá)水平從0.38±0.03增加到0.79±0.06(P0.05vs CDDP)。7在過表達(dá)骨膜蛋白的A549細(xì)胞中沉默survivin之后,流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示:10μMCDDP處理組,骨膜蛋白過表達(dá)組細(xì)胞早期凋亡率分別為:26.89±2.24%,13.13±1.54%,細(xì)胞中晚期凋亡/壞死率分別為:13.24±2.63%,8.42±2.57%;相對于POSTN過表達(dá)組,POSTN+S-sh RNA組細(xì)胞早期凋亡率由13.13±1.54%增加到19.97±2.14%(P0.05 vs POSTN)。除此之外,過表達(dá)POSTN可明顯抑制A549細(xì)胞上CDDP誘導(dǎo)的Caspase-3的活化,但干擾survivin的表達(dá)之后,這一抑制作用被逆轉(zhuǎn)(P0.05 vs CDDP)。結(jié)論:成功構(gòu)建了骨膜蛋白過表達(dá)載體,研究表明在A549細(xì)胞中外源性過表達(dá)骨膜蛋白可通過促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換,促進(jìn)細(xì)胞增殖,同時抑制細(xì)胞凋亡,逆轉(zhuǎn)順鉑的促凋亡作用。其作用機(jī)制可能是骨膜蛋白激活Stat3/survivin信號通路,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡抵抗。第三部分沉默骨膜蛋白逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥的體內(nèi)外研究目的:利用骨膜蛋白干擾sh RNA構(gòu)建骨膜蛋白低表達(dá)的耐藥細(xì)胞A549/CDDP,探討沉默骨膜蛋白是否可以在體外逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌耐藥的發(fā)生及相關(guān)作用機(jī)制;通過建立裸鼠非小細(xì)胞肺癌異體移植瘤模型,在體內(nèi)進(jìn)一步探討沉默骨膜蛋白的表達(dá)對非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥的影響。方法:1利用骨膜蛋白干擾sh RNA沉默耐藥細(xì)胞A549/CDDP中骨膜蛋白的表達(dá),通過MTT、流式細(xì)胞術(shù)、western blot檢測技術(shù)觀察細(xì)胞生存率及細(xì)胞凋亡等相關(guān)生物學(xué)行為的改變。2建立裸鼠非小細(xì)胞肺癌異體移植瘤模型,觀察沉默骨膜蛋白的表達(dá)對順鉑抑瘤效率的影響,比較分析腫瘤組織中Stat3/survivin信號通路活性的變化。結(jié)果:1采用western blot的方法檢測經(jīng)G418篩選后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染P-sh RNA的A549/CDDP中骨膜蛋白的干擾效率。結(jié)果顯示:P-sh RNA組骨膜蛋白的表達(dá)是對照組的0.42±0.09倍,且位置正確。說明轉(zhuǎn)染P-sh RNA可顯著降低內(nèi)源性骨膜蛋白的表達(dá)。2 MTT結(jié)果顯示:同對照組相比,0~30μMCDDP刺激下P-sh RNA組細(xì)胞活力分別為1.0±0.05、0.7±0.04、0.64±0.09倍(P0.05),說明外源性沉默骨膜蛋白可提高耐藥細(xì)胞株A549/CDDP對順鉑的敏感性。3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):對照組(A549/CDDP),30μM CDDP處理組,CDDP+C-sh RNA處理組細(xì)胞早期凋亡率分別為:2.15±0.41%,13.41±2.43%,15.14±2.54%,細(xì)胞中晚期凋亡/壞死率分別為:1.92±0.32%,8.83±2.01%,10.01±2.37%;相對于CDDP處理組,CDDP+P-sh RNA組細(xì)胞早期凋亡率由13.41±2.43%增加到29.87±3.21%,細(xì)胞中晚期凋亡/壞死率則由8.83±2.01%增加到20.13±3.14%(P0.05 vs CDDP)。4通過對移植瘤體積的測量發(fā)現(xiàn),用藥前各組裸鼠移植瘤平均體積未見統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);給予PBS或CDDP干預(yù)20天后,C-sh RNA+PBS組、P-sh RNA+PBS組、C-sh RNA+CDDP組、P-sh RNA+CDDP組移植瘤體積分別為(2900±150.28)、(2100±135.16)、(1630.75±109.60)、(445±41.04)mm3,均大于各組給藥前體積(P0.01),P-sh RNA+CDDP組移植瘤體積最小。5對移植瘤組織中Stat3/survivin信號通路活性的檢測發(fā)現(xiàn):同C-sh RNA+PBS組相比,C-sh RNA+CDDP治療組移植瘤組織中Stat3的磷酸化水平降低到0.63±0.06倍,沉默骨膜蛋白后,P-sh RNA+CDDP治療組移植瘤組織中Stat3的磷酸化水平則進(jìn)一步降低至0.32±0.03(P0.05vs C-sh RNA);同C-sh RNA+PBS組相比,C-sh RNA+CDDP治療組移植瘤組織中survivin的表達(dá)水平降低到0.58±0.07倍,沉默骨膜蛋白后,P-sh RNA+CDDP治療組移植瘤組織中survivin的表達(dá)水平則進(jìn)一步降低至0.21±0.02(P0.05vs C-sh RNA)。結(jié)論:1沉默骨膜蛋白可顯著增加人非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥細(xì)胞A549/CDDP對順鉑的敏感性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。2體內(nèi)研究同樣顯示沉默骨膜蛋白可提高順鉑的抑瘤效率,并抑制Stat3的磷酸化及其下游靶基因Survivin蛋白的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1490328