發(fā)布時(shí)間：2018-02-04 13:55

  本文關(guān)鍵詞： 肝細(xì)胞癌 索拉非尼 UGT1A9 miRNA　出處：《福建醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和目的肝細(xì)胞癌是起源于肝細(xì)胞的腫瘤,是肝臟最常見的原發(fā)腫瘤,在全世界內(nèi),排在男性惡性腫瘤第五位,排在女性惡性腫瘤第七位。我國屬于肝癌高發(fā)地區(qū),占世界肝癌發(fā)病率的一半左右。流行病學(xué)研究顯示,肝癌發(fā)生與HBV感染、HCV感染,黃曲霉毒素,酗酒等因素相關(guān)。在我國,肝癌主要由于HBV感染密切相關(guān)引起,大約75%-80%原發(fā)性肝癌患者HBs Ag檢測(cè)陽性。HBV引起的肝炎-肝硬化-肝癌這樣三步基本過程,而我國乙肝病毒攜帶者將近一億人,導(dǎo)致每年大量新發(fā)肝癌病例,防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻。盡管部分早期肝癌患者經(jīng)手術(shù)切除或肝移植有治愈的可能,但是大部分肝癌患者確診時(shí)已屬于肝癌晚期,無法進(jìn)行手術(shù)切除,只有采取姑息治療。隨著醫(yī)學(xué)研究及技術(shù)進(jìn)步,多種新理論和方法應(yīng)用于肝癌治療,綜合治療有效提高了肝癌的生存率。大量研究表明,肝癌發(fā)生發(fā)展中存在多個(gè)促癌信號(hào)通路的異常激活,例如EGF/IGF/HGF信號(hào)通路,RAS/MAPK通路,AKT/m TOR通路,TGF-β通路以及Wnt-βcatenin信號(hào)通路等。因此,針對(duì)阻斷這些促癌信號(hào)通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分子的靶向藥成為治療肝癌新藥開發(fā)的熱點(diǎn)。新型的生物靶向藥物的出現(xiàn)給肝癌治療帶來了新的希望,然而,肝癌患者中存在很強(qiáng)的異質(zhì)性,促癌通路的激活并非一致,這使得很多針對(duì)個(gè)別促癌通路的抑制劑臨床試驗(yàn)宣告失敗,例如EGF信號(hào)通路阻斷劑恩羅替尼。2007年靶向肝癌治療的領(lǐng)域有了重大的突破。多激酶抑制劑索拉非尼的三期臨床試驗(yàn)表明口服索拉非尼可以顯著提高晚期肝癌的生存率。索拉非尼是一種多激酶抑制劑,通過抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶(B-RAF)、受體酪氨酸激酶(VEGFR2,PDGFR,c-Kit受體)從而抑制腫瘤增殖及其血管生成。索拉非尼已經(jīng)獲得美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn),成為目前唯一口服的晚期肝癌治療靶向藥物。然而后續(xù)索拉非尼研究進(jìn)展顯示其療效個(gè)體差異十分明顯,因此闡明索拉非尼的作用原理、代謝方式及最大化其生物活性作用對(duì)于索拉非尼個(gè)體化治療的選擇至關(guān)重要。UGT1A9是索拉非尼在體內(nèi)的二相代謝酶,通過轉(zhuǎn)移葡萄糖醛酸基團(tuán),增加索拉非尼親水性,利于其排出體內(nèi),其在轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄修飾的機(jī)制研究較多,而其在表觀水平的調(diào)控機(jī)制鮮有報(bào)道。mi RNA是一種生物體內(nèi)產(chǎn)生的小RNA,長度大約20-25個(gè)核苷酸,在表觀遺傳學(xué)調(diào)控方面發(fā)揮重要作用,通過與靶基因3′-UTR互補(bǔ)配對(duì)起到對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)作用,其作用機(jī)制與互補(bǔ)程度密切相關(guān),完全互補(bǔ)切斷靶基因,降解下調(diào)靶基因,不完全互補(bǔ)抑制靶基因。本研究旨在通過探討mi RNA對(duì)二相代謝酶UGT1A9的調(diào)節(jié),探索對(duì)于索拉非尼代謝及其藥效的影響,從而為索拉非尼臨床用藥提供重要的科學(xué)依據(jù)。研究方法1.PCR檢測(cè)細(xì)胞系及肝癌及癌旁組織中CYP3A4及UGT1A9的表達(dá)情況。2.利用生物信息學(xué)分析軟件,預(yù)測(cè)作用于UGT1A9的候選mi RNA。3.通過將候選mi RNA轉(zhuǎn)染高表達(dá)UGT1A9的SMMC-7721細(xì)胞,抽提RNA,反轉(zhuǎn)錄,利用RT-PCR檢測(cè)mi RNA對(duì)UGT1A9表達(dá)的影響,驗(yàn)證候選mi RNA。4.通過構(gòu)建過表達(dá)UGT1A9的3′-UTR報(bào)告基因質(zhì)粒,質(zhì)粒及候選mi RNA共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞,利用報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證候選mi RNA。5.利用東方肝膽外科醫(yī)院樣本庫收集的肝細(xì)胞癌病人肝癌及癌旁組織,提取RNA,反轉(zhuǎn)錄,設(shè)計(jì)UGT1A9及候選mi RNA檢測(cè)引物,RT-PCR檢測(cè)UGT1A9及候選mi RNA在肝臟及肝癌組織中的表達(dá)情況,利用SPSS軟件分析UGT1A9及mi RNA表達(dá)的相關(guān)性,檢測(cè)體內(nèi)調(diào)節(jié)UGT1A9的mi RNA。6.構(gòu)建UGT1A9的3′-UTR突變體報(bào)告基因質(zhì)粒,進(jìn)一步驗(yàn)證候選mi RNA。7.利用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞系經(jīng)sorafenib刺激后的增殖情況。8.構(gòu)建UGT1A9過表達(dá)細(xì)胞系Huh7、干擾細(xì)胞系SMMC-7721,細(xì)胞培養(yǎng)基中加入索拉非尼刺激,利用CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖變化,觀察索拉非尼的藥效。9.mi R-200a-3p及mi R-183-5p瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞,培養(yǎng)基中使用索拉非尼刺激,利用CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖變化,從而反應(yīng)索拉非尼的藥效,同時(shí)質(zhì)譜分析細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞裂解液,分析索拉非尼代謝產(chǎn)物的變化。10.收集東方肝膽外科醫(yī)院肝癌病人蠟塊組織,制作組織芯片,利用免疫組化檢測(cè)癌和癌旁中UGT1A9表達(dá),利用SPSS軟件分析UGT1A9表達(dá)與服用索拉非尼病人預(yù)后的相關(guān)性。11.PCR檢測(cè)肝細(xì)胞癌病人肝癌及癌旁組織中索拉非尼代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp、BRCP、MRP2表達(dá)情況,分析腫瘤中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)情況。結(jié)果1.PCR檢測(cè)肝癌細(xì)胞系、原發(fā)性肝癌患者肝癌及癌旁組織中CYP3A4及UGT1A9的表達(dá)情況,已檢測(cè)的永生化細(xì)胞系均未見CYP3A4的表達(dá),其中MHCC-97H,SMMC-7721高表達(dá)UGT1A9;Huh7,PLC,PVTT,Hep G2低表達(dá)UGT1A9,癌旁組織中這兩種蛋白表達(dá)高于肝癌組織。2.利用生物信息學(xué)軟件Targetscan、mi RDB和mi Rande預(yù)測(cè)可能作用于UGT1A9的候選mi RNA共47個(gè)。3.將軟件預(yù)測(cè)的47個(gè)外源性mi RNA-mimic轉(zhuǎn)入SMMC-7721細(xì)胞,其中12個(gè)mi RNA-minic致使UGT1A9在m RNA水平表達(dá)下降50%以上。4.構(gòu)建過表達(dá)UGT1A9的3′-UTR報(bào)告基因質(zhì)粒,將質(zhì)粒及候選mi RNA共轉(zhuǎn)HEK-HEK293T細(xì)胞,利用報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)熒光素酶活性,將上述候選mi RNA縮減為11個(gè)。5.上述11個(gè)mi RNA中,其中3個(gè)在人體肝臟及肝癌組織中未見表達(dá),另外8個(gè)在肝臟中有表達(dá),檢測(cè)8個(gè)候選mi RNA在肝臟中的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)mi RNA-200a-3p以及mi RNA-183-5p的表達(dá)UGT1A9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。6.構(gòu)建候選mi RNA作用位點(diǎn)UGT1A9 3′-UTR突變體報(bào)告基因質(zhì)粒,將該質(zhì)粒與候選mi RNA-mimic共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞,細(xì)胞裂解液利用報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)熒光素酶活性后發(fā)現(xiàn),突變UGT1A9 3′-UTR后熒光素酶活性未見明顯變化。7.細(xì)胞系經(jīng)sorafenib刺激72小時(shí)后,利用CCK8檢測(cè)增殖情況,發(fā)現(xiàn)高表達(dá)UGT1A9的細(xì)胞系(MHCC-97H,SMMC-7721)增殖情況優(yōu)于低表達(dá)UGT1A9的細(xì)胞系(Huh7,PLC,PVTT以及He PG2)。8.過表達(dá)UGT1A9細(xì)胞系Huh7、干擾細(xì)胞系SMMC-7721,索拉非尼刺激,CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖情況無明顯變化。9.mi R-200a-3p,mi R-183-5p轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞,索拉非尼刺激,CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖未見明顯變化,對(duì)索拉非尼藥效無明顯影響;然而質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染mi RNA后葡萄糖醛酸化索拉非尼明顯減少。10.免疫組化檢測(cè)UGT1A9表達(dá),利用SPSS軟件分析UGT1A9表達(dá)與服用索拉非尼病人預(yù)后明顯相關(guān),肝癌組織中高表達(dá)UGT1A9病人預(yù)后優(yōu)于低表達(dá)UGT1A9病人。11.PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌病人肝癌及癌旁組織中轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp、BRCP、MRP2表達(dá)存在明顯差異,癌中轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)下調(diào),可能影響藥物轉(zhuǎn)運(yùn),導(dǎo)致癌中高表達(dá)UGT1A9病人生存期優(yōu)于低表達(dá)UGT1A9病人。結(jié)論本研究首次發(fā)現(xiàn)mi R-200a-3p,mi R-183-5p mimic轉(zhuǎn)入SMMC-7721內(nèi),明顯抑制UGT1A9 m RNA水平,同時(shí)sorafenib代謝產(chǎn)物葡萄糖醛酸化的索拉非尼(sorafenib-glucuronide)明顯減少。mi R-200a-3p,mi R-183-5p是UGT1A9重要的調(diào)控因子,肝癌組織中高表達(dá)UGT1A9提示預(yù)后優(yōu)于低表達(dá)病人。肝癌組織中高表達(dá)UGT1A9可以作為提示服用索拉非尼預(yù)后良好的潛在指標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 Wanqing Chen;Rongshou Zheng;Siwei Zhang;Ping Zhao;Guanglin Li;Lingyou Wu;Jie He;;Report of incidence and mortality in China cancer registries, 2009[J];Chinese Journal of Cancer Research;2013年01期

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本文編號(hào)：1490373