本文關(guān)鍵詞： 肝細胞癌 索拉非尼 UGT1A9 miRNA　出處：《福建醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和目的肝細胞癌是起源于肝細胞的腫瘤,是肝臟最常見的原發(fā)腫瘤,在全世界內(nèi),排在男性惡性腫瘤第五位,排在女性惡性腫瘤第七位。我國屬于肝癌高發(fā)地區(qū),占世界肝癌發(fā)病率的一半左右。流行病學(xué)研究顯示,肝癌發(fā)生與HBV感染、HCV感染,黃曲霉毒素,酗酒等因素相關(guān)。在我國,肝癌主要由于HBV感染密切相關(guān)引起,大約75%-80%原發(fā)性肝癌患者HBs Ag檢測陽性。HBV引起的肝炎-肝硬化-肝癌這樣三步基本過程,而我國乙肝病毒攜帶者將近一億人,導(dǎo)致每年大量新發(fā)肝癌病例,防控形勢十分嚴峻。盡管部分早期肝癌患者經(jīng)手術(shù)切除或肝移植有治愈的可能,但是大部分肝癌患者確診時已屬于肝癌晚期,無法進行手術(shù)切除,只有采取姑息治療。隨著醫(yī)學(xué)研究及技術(shù)進步,多種新理論和方法應(yīng)用于肝癌治療,綜合治療有效提高了肝癌的生存率。大量研究表明,肝癌發(fā)生發(fā)展中存在多個促癌信號通路的異常激活,例如EGF/IGF/HGF信號通路,RAS/MAPK通路,AKT/m TOR通路,TGF-β通路以及Wnt-βcatenin信號通路等。因此,針對阻斷這些促癌信號通路關(guān)鍵節(jié)點分子的靶向藥成為治療肝癌新藥開發(fā)的熱點。新型的生物靶向藥物的出現(xiàn)給肝癌治療帶來了新的希望,然而,肝癌患者中存在很強的異質(zhì)性,促癌通路的激活并非一致,這使得很多針對個別促癌通路的抑制劑臨床試驗宣告失敗,例如EGF信號通路阻斷劑恩羅替尼。2007年靶向肝癌治療的領(lǐng)域有了重大的突破。多激酶抑制劑索拉非尼的三期臨床試驗表明口服索拉非尼可以顯著提高晚期肝癌的生存率。索拉非尼是一種多激酶抑制劑,通過抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶(B-RAF)、受體酪氨酸激酶(VEGFR2,PDGFR,c-Kit受體)從而抑制腫瘤增殖及其血管生成。索拉非尼已經(jīng)獲得美國食品藥品管理局(FDA)批準,成為目前唯一口服的晚期肝癌治療靶向藥物。然而后續(xù)索拉非尼研究進展顯示其療效個體差異十分明顯,因此闡明索拉非尼的作用原理、代謝方式及最大化其生物活性作用對于索拉非尼個體化治療的選擇至關(guān)重要。UGT1A9是索拉非尼在體內(nèi)的二相代謝酶,通過轉(zhuǎn)移葡萄糖醛酸基團,增加索拉非尼親水性,利于其排出體內(nèi),其在轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄修飾的機制研究較多,而其在表觀水平的調(diào)控機制鮮有報道。mi RNA是一種生物體內(nèi)產(chǎn)生的小RNA,長度大約20-25個核苷酸,在表觀遺傳學(xué)調(diào)控方面發(fā)揮重要作用,通過與靶基因3′-UTR互補配對起到對靶基因的調(diào)節(jié)作用,其作用機制與互補程度密切相關(guān),完全互補切斷靶基因,降解下調(diào)靶基因,不完全互補抑制靶基因。本研究旨在通過探討mi RNA對二相代謝酶UGT1A9的調(diào)節(jié),探索對于索拉非尼代謝及其藥效的影響,從而為索拉非尼臨床用藥提供重要的科學(xué)依據(jù)。研究方法1.PCR檢測細胞系及肝癌及癌旁組織中CYP3A4及UGT1A9的表達情況。2.利用生物信息學(xué)分析軟件,預(yù)測作用于UGT1A9的候選mi RNA。3.通過將候選mi RNA轉(zhuǎn)染高表達UGT1A9的SMMC-7721細胞,抽提RNA,反轉(zhuǎn)錄,利用RT-PCR檢測mi RNA對UGT1A9表達的影響,驗證候選mi RNA。4.通過構(gòu)建過表達UGT1A9的3′-UTR報告基因質(zhì)粒,質(zhì)粒及候選mi RNA共轉(zhuǎn)HEK293T細胞,利用報告基因?qū)嶒炦M一步驗證候選mi RNA。5.利用東方肝膽外科醫(yī)院樣本庫收集的肝細胞癌病人肝癌及癌旁組織,提取RNA,反轉(zhuǎn)錄,設(shè)計UGT1A9及候選mi RNA檢測引物,RT-PCR檢測UGT1A9及候選mi RNA在肝臟及肝癌組織中的表達情況,利用SPSS軟件分析UGT1A9及mi RNA表達的相關(guān)性,檢測體內(nèi)調(diào)節(jié)UGT1A9的mi RNA。6.構(gòu)建UGT1A9的3′-UTR突變體報告基因質(zhì)粒,進一步驗證候選mi RNA。7.利用CCK8實驗檢測細胞系經(jīng)sorafenib刺激后的增殖情況。8.構(gòu)建UGT1A9過表達細胞系Huh7、干擾細胞系SMMC-7721,細胞培養(yǎng)基中加入索拉非尼刺激,利用CCK8檢測細胞增殖變化,觀察索拉非尼的藥效。9.mi R-200a-3p及mi R-183-5p瞬時轉(zhuǎn)染SMMC-7721細胞,培養(yǎng)基中使用索拉非尼刺激,利用CCK8檢測細胞增殖變化,從而反應(yīng)索拉非尼的藥效,同時質(zhì)譜分析細胞培養(yǎng)上清及細胞裂解液,分析索拉非尼代謝產(chǎn)物的變化。10.收集東方肝膽外科醫(yī)院肝癌病人蠟塊組織,制作組織芯片,利用免疫組化檢測癌和癌旁中UGT1A9表達,利用SPSS軟件分析UGT1A9表達與服用索拉非尼病人預(yù)后的相關(guān)性。11.PCR檢測肝細胞癌病人肝癌及癌旁組織中索拉非尼代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運體P-gp、BRCP、MRP2表達情況,分析腫瘤中藥物轉(zhuǎn)運情況。結(jié)果1.PCR檢測肝癌細胞系、原發(fā)性肝癌患者肝癌及癌旁組織中CYP3A4及UGT1A9的表達情況,已檢測的永生化細胞系均未見CYP3A4的表達,其中MHCC-97H,SMMC-7721高表達UGT1A9;Huh7,PLC,PVTT,Hep G2低表達UGT1A9,癌旁組織中這兩種蛋白表達高于肝癌組織。2.利用生物信息學(xué)軟件Targetscan、mi RDB和mi Rande預(yù)測可能作用于UGT1A9的候選mi RNA共47個。3.將軟件預(yù)測的47個外源性mi RNA-mimic轉(zhuǎn)入SMMC-7721細胞,其中12個mi RNA-minic致使UGT1A9在m RNA水平表達下降50%以上。4.構(gòu)建過表達UGT1A9的3′-UTR報告基因質(zhì)粒,將質(zhì)粒及候選mi RNA共轉(zhuǎn)HEK-HEK293T細胞,利用報告基因?qū)嶒灆z測熒光素酶活性,將上述候選mi RNA縮減為11個。5.上述11個mi RNA中,其中3個在人體肝臟及肝癌組織中未見表達,另外8個在肝臟中有表達,檢測8個候選mi RNA在肝臟中的表達后發(fā)現(xiàn)mi RNA-200a-3p以及mi RNA-183-5p的表達UGT1A9表達呈負相關(guān)。6.構(gòu)建候選mi RNA作用位點UGT1A9 3′-UTR突變體報告基因質(zhì)粒,將該質(zhì)粒與候選mi RNA-mimic共轉(zhuǎn)HEK293T細胞,細胞裂解液利用報告基因?qū)嶒灆z測熒光素酶活性后發(fā)現(xiàn),突變UGT1A9 3′-UTR后熒光素酶活性未見明顯變化。7.細胞系經(jīng)sorafenib刺激72小時后,利用CCK8檢測增殖情況,發(fā)現(xiàn)高表達UGT1A9的細胞系(MHCC-97H,SMMC-7721)增殖情況優(yōu)于低表達UGT1A9的細胞系(Huh7,PLC,PVTT以及He PG2)。8.過表達UGT1A9細胞系Huh7、干擾細胞系SMMC-7721,索拉非尼刺激,CCK8實驗檢測發(fā)現(xiàn)細胞增殖情況無明顯變化。9.mi R-200a-3p,mi R-183-5p轉(zhuǎn)染SMMC-7721細胞,索拉非尼刺激,CCK8實驗檢測細胞增殖未見明顯變化,對索拉非尼藥效無明顯影響;然而質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染mi RNA后葡萄糖醛酸化索拉非尼明顯減少。10.免疫組化檢測UGT1A9表達,利用SPSS軟件分析UGT1A9表達與服用索拉非尼病人預(yù)后明顯相關(guān),肝癌組織中高表達UGT1A9病人預(yù)后優(yōu)于低表達UGT1A9病人。11.PCR檢測發(fā)現(xiàn)肝細胞癌病人肝癌及癌旁組織中轉(zhuǎn)運體P-gp、BRCP、MRP2表達存在明顯差異,癌中轉(zhuǎn)運體表達下調(diào),可能影響藥物轉(zhuǎn)運,導(dǎo)致癌中高表達UGT1A9病人生存期優(yōu)于低表達UGT1A9病人。結(jié)論本研究首次發(fā)現(xiàn)mi R-200a-3p,mi R-183-5p mimic轉(zhuǎn)入SMMC-7721內(nèi),明顯抑制UGT1A9 m RNA水平,同時sorafenib代謝產(chǎn)物葡萄糖醛酸化的索拉非尼(sorafenib-glucuronide)明顯減少。mi R-200a-3p,mi R-183-5p是UGT1A9重要的調(diào)控因子,肝癌組織中高表達UGT1A9提示預(yù)后優(yōu)于低表達病人。肝癌組織中高表達UGT1A9可以作為提示服用索拉非尼預(yù)后良好的潛在指標。
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【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Wanqing Chen;Rongshou Zheng;Siwei Zhang;Ping Zhao;Guanglin Li;Lingyou Wu;Jie He;;Report of incidence and mortality in China cancer registries, 2009[J];Chinese Journal of Cancer Research;2013年01期

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本文編號：1490373