本文關(guān)鍵詞： 膠質(zhì)母細胞瘤 膠質(zhì)瘤干細胞 侵襲 細胞運動 Notch 信號通路 肌動蛋白細胞骨架 Arp2/3復(fù)合體　出處：《天津醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:膠質(zhì)母細胞瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤。肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)分子—Arp2/3復(fù)合體對膠質(zhì)瘤細胞運動和遷移至關(guān)重要,促進腫瘤侵襲。本研究旨在研究肌動蛋白細胞骨架是否參與維持干細胞表型,及其干細胞表型維持過程中的作用。內(nèi)容:探究膠質(zhì)瘤干細胞在原發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤中的存在和分布形式。研究干細胞標志物在膠質(zhì)瘤干細胞中的表達水平,評價膠質(zhì)瘤干細胞的自我更新能力。檢測Arp2/3復(fù)合體是否參與膠質(zhì)瘤干細胞表型的維持,以及潛在調(diào)控機制。方法:收集14例膠質(zhì)母細胞瘤患者腫瘤中心區(qū)域的組織標本,利用免疫組織化學染色檢測干細胞標志物(CD133,Nestin,Notch1和Delta-like1)和細胞分化標志物(GFAP和Tu J1)在腫瘤細胞中的表達水平和分布情況。免疫磁珠分選技術(shù)富集CD133+U87-MG和U251-MG膠質(zhì)瘤干細胞,采用三維膠質(zhì)瘤細胞球培養(yǎng)獲得具有自我更新能力的膠質(zhì)瘤干細胞。Western blot、免疫熒光染色和單細胞成球?qū)嶒灧謩e用來檢測干細胞標志物在體外CD133+膠質(zhì)瘤細胞球中的表達及其自我更新能力。綜合干細胞標志物表達水平和自我更新能力評價膠質(zhì)瘤干細胞表型。利用慢病毒載體shRNA敲低Delta-like1(DLL1)和Arp2,以及Arp2/3復(fù)合體特異性抑制劑CK636,探究其對膠質(zhì)瘤干細胞表型維持的作用。同時應(yīng)用分離亞細胞蛋白的Western blot和免疫熒光染色檢測敲低Arp2對DLL1亞細胞定位的影響。建立顱內(nèi)原位種植穩(wěn)定表達熒光素酶的CD133+U87-MG膠質(zhì)瘤細胞的裸鼠模型,驗證敲低Arp2對膠質(zhì)瘤干細胞體內(nèi)成瘤能力的影響。結(jié)果:原發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤患者腫瘤標本中,CD133+、Nestin+、Notch1+和DLL1+腫瘤干細胞聚集形成管狀結(jié)構(gòu),GFAP+和TuJ1+腫瘤細胞呈片狀聚集于遠離上述管狀結(jié)構(gòu)的區(qū)域,進一步的免疫熒光染色顯示Notch1和DLL1共表達于上述腫瘤干細胞,部分位于管狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的DLL1+腫瘤細胞同時表達內(nèi)皮標志物CD31。體外實驗中,流式細胞術(shù)檢測經(jīng)過免疫磁珠分選后的CD133+U87-MG細胞比例為84.70±2.70%,CD133+U251-MG細胞比例為74.23±2.43%。CD133+細胞在干細胞培養(yǎng)基中形成三維膠質(zhì)瘤細胞球,Western blot和免疫熒光染色顯示CD133+膠質(zhì)瘤細胞球干性標志物CD133和Nestin,Notch通路組分Notch1、NICD1和DLL1的表達水平顯著高于10%血清培養(yǎng)貼壁生長未經(jīng)篩選的膠質(zhì)瘤細胞,細胞分化標志物GFAP和TuJ1的表達水平則顯著降低。shRNA敲低DLL1顯著降低U87-MG和U251-MG膠質(zhì)瘤細胞球干性標志物CD133和Nestin表達,降低Notch通路活性(NICD1和HES1表達下降),GFAP和TuJ1表達水平顯著升高;shDLL1還顯著降低了膠質(zhì)瘤干細胞的單細胞成球能力(p0.05)。shRNA敲低Arp2和抑制劑CK636抑制U87-MG和U251-MG膠質(zhì)瘤細胞片狀偽足形成,同時顯著降低CD133、Nestin、NICD1和HES1,升高GFAP和TuJ1的表達水平,shArp2和CK636還還顯著降低了膠質(zhì)瘤干細胞的單細胞成球能力(p0.05)。然而,同時敲低DLL1和Arp2未進一步降低CD133、Nestin、NICD1和HES1,升高GFAP和TuJ1的表達水平,未進一步降低單細胞成球能力,但外源可溶性DLL1卻恢復(fù)了敲低DLL1和Arp2引起的干細胞表型的缺失。潛在機制是Arp2/3復(fù)合體維持DLL1的亞細胞定位,Western blot和免疫熒光染色提示shArp2和CK636降低細胞膜上DLL1的表達,增加了細胞質(zhì)中DLL1的表達。顱內(nèi)原位種植模型中,敲低Arp2顯著降低CD133+U87-MG膠質(zhì)瘤細胞的致瘤能力。結(jié)論:Notch配體DLL1依賴于細胞骨架調(diào)控分子Arp2/3復(fù)合體,維持Notch通路活性,進而維持膠質(zhì)瘤干細胞表型。細胞骨架參與膠質(zhì)母細胞瘤干細胞表型的調(diào)控過程,為靶向腫瘤侵襲遷移的治療策略提供理論支持和創(chuàng)新思路。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.41

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本文編號：1490009