本文關(guān)鍵詞： 定量多色熒光原位雜交 卵巢癌 基因拷貝數(shù)變化 卵巢癌干細胞 MYC RB1　出處：《天津醫(yī)科大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：卵巢癌死亡率高居婦科腫瘤的首位,治療策略為腫瘤減滅手術(shù)聯(lián)合以鉑類藥物為基礎的化學治療。近年來雖然患者生存率有所提高,但約有80-85%的卵巢癌患者會復發(fā),并對化療藥物如順鉑產(chǎn)生耐受,五年生存率徘徊于30-40%。隨著細胞遺傳學與腫瘤病因?qū)W研究的不斷深入,各種研究顯示染色體不穩(wěn)定性即非整倍體和結(jié)構(gòu)重排(缺失、基因擴增和易位)與腫瘤的形成和發(fā)展密切相關(guān)。然而針對卵巢癌相關(guān)的多基因拷貝數(shù)變化研究尚處于起步階段。定量多基因熒光原位雜交技術(shù),簡稱QM-FISH(Quantitative Multi-gene Fluorescencein situ Hybridization),QM-FISH技術(shù)關(guān)鍵在于基因組合探針設計、探針制備、標本制備和分子雜交條件的優(yōu)化。相較于傳統(tǒng)的FISH技術(shù)信噪比提高了5-10倍,可以在同一時間內(nèi)定量單個腫瘤細胞核的多個基因(目前可同時定量20余個基因),且可以自由組合目的基因。該技術(shù)是尋找和確認腫瘤臨床標本的特異性等位基因失衡極其有效的工具,可以用于大規(guī)模研究臨床腫瘤標本基因拷貝數(shù)的變化(等位基因失衡)。此外QM-FISH對確定腫瘤細胞耐藥亞群、疾病進展時的克隆演變和識別腫瘤干細胞也有顯著的作用。本研究首次將QM-FISH技術(shù)應用于卵巢癌的研究,以發(fā)現(xiàn)進展期上皮性卵巢癌多基因拷貝數(shù)異常變化的規(guī)律。隨著細胞遺傳學與腫瘤病因?qū)W研究的不斷深入,各種研究顯示染色體不穩(wěn)定性即非整倍體和結(jié)構(gòu)重排(缺失、基因擴增和易位)與腫瘤的形成和發(fā)展密切相關(guān)。包括比較基因組雜交等的卵巢癌基因組異常相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)包括MYC、RB1、CHEK2、TP53和BRCA1等一系列重要基因在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此我們在研究中設計了包括該五個基因的探針組合,對合成探針所用BAC克隆進行了鑒定,并使用外周血單個核細胞對探針進行了驗證。該研究將用合成的探針應用于卵巢癌標本的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)圖像清晰,能夠獲得滿意的熒光信號強度和熒光信號強度/背景信號比值,信號分裂率低。由于臨床標本種類較多,本研究進一步將QM-FISH技術(shù)應用于卵巢癌的多種標本類型包括石蠟切片、冰凍切片、組織印片和細胞甩片,對各種標本進行對比并制定出相應的標本選擇策略。顯示出在各種標本都能獲得的情況下,應該首選使用冰凍切片,其次選用石蠟切片。在給予手術(shù)治療的患者中則應選擇組織印片標本。腹水陽性的進展期卵巢癌患者無論病人手術(shù)與否都可直接使用腹水腫瘤細胞標本甩片后進行FISH檢測。研究的第二部分應用自制的熒光標記探針,分別在10名復發(fā)性進展期上皮性卵巢癌患者的腹水腫瘤細胞標本中檢測了myc、rb1、chek2、tp53和brca1共計5個基因的拷貝數(shù)異常。結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%的病例中出現(xiàn)了myc擴增,40%的患者中發(fā)生了rb1缺失現(xiàn)象。針對出現(xiàn)頻率較高的myc擴增和rb1缺失,將研究范圍擴大至58例上皮性卵巢癌患者,通過進一步研究發(fā)現(xiàn)在近三分之一的患者中同時出現(xiàn)了這兩種染色體異常。在卵巢癌石蠟切片的免疫組化和腹水細胞的western結(jié)果印證了myc擴增造成蛋白表達水平上升。結(jié)合臨床病理資料和術(shù)后隨訪,研究發(fā)現(xiàn)在figoiii-iv期上皮性卵巢癌中rb1基因缺失明顯增加,低分化-未分化組的rb1基因缺失率較高分化-中分化組明顯增加。研究同時發(fā)現(xiàn)rb1基因缺失的患者生存期較不存在rb1基因缺失的患者顯著縮短。對比典型的復發(fā)性上皮性卵巢癌患者初診時和復發(fā)后的定量多色原位基因雜交結(jié)果,觀察到克隆演化現(xiàn)象的發(fā)生。復發(fā)后,亞克隆“4myc1rb”的比例由初診時的11.00%上升至27.59%,同時伴有2個亞克隆的新生。該研究提示rb1基因缺失可以作為指導卵巢癌分期和預測疾病預后的指標之一。根據(jù)前兩部分研究工作結(jié)果,我們申請《一種檢測上皮性卵巢癌的基因探針組合物及試劑盒(201310106080.4)》獲得國家專利授權(quán)。該專利技術(shù)提供了一種檢測上皮性卵巢癌的基因探針組合物,包括myc基因探針、rb1基因探針、chek2基因探針、tp53基因探針和brca1基因探針,該技術(shù)可對上皮性卵巢癌同一樣本甚至上皮性卵巢癌單個腫瘤細胞同時進行5基因的檢測。該試劑盒可以用于確定上皮性卵巢癌的分子病理類型,判斷病情預后,指導個體化治療,評估臨床治療效果,監(jiān)測病灶復發(fā)和轉(zhuǎn)移。卵巢癌干細胞,與該腫瘤發(fā)生、進展、復發(fā)、耐藥、常見種植轉(zhuǎn)移等現(xiàn)象密切相關(guān)。因此本研究的第三部分利用流式細胞術(shù)分選腹水腫瘤細胞中aldh陽性亞群富集卵巢癌干細胞,對aldh陽性細胞使用卵巢癌干細胞培養(yǎng)體系進行培養(yǎng)可獲得成球細胞,經(jīng)流式細胞術(shù)和免疫熒光染色鑒定成球細胞具有卵巢癌干細胞表型。定量多色原位基因雜交顯示,在復發(fā)性卵巢癌患者腹水腫瘤干細胞與腫瘤細胞相比,亞克隆數(shù)較少,且染色體變異程度較低。myc出現(xiàn)了不同程度的拷貝數(shù)增加。發(fā)現(xiàn)1例患者在不同的亞克隆中分別出現(xiàn)brca1、tp53、chek2、rb1缺失的多種組合。由于在上皮性卵巢癌干細胞水平確認了myc和rb1的染色體異常,本研究的第四部分進一步擴大研究范圍,利用芯片數(shù)據(jù),對比上皮性卵巢癌干細胞和腫瘤細胞的表達譜,篩選出若干腫瘤干細胞水平特異的表達譜變化。對其信號通路的分析發(fā)現(xiàn),ErbB通路往往出現(xiàn)整體異常。以這些異常表達基因為基礎,在CMAP數(shù)據(jù)庫中篩選出18種已知的小分子藥物。其中某些小分子已經(jīng)在其他腫瘤中展現(xiàn)出治療效果,部分克服了腫瘤細胞的抗藥性,這些小分子有望在卵巢癌治療中發(fā)揮作用。
[Abstract]:In recent years , it has been shown that chromosome instability , i.e . , non - euploid and structural rearrangement ( deletion , gene amplification and translocation ) plays an important role in the development of ovarian cancer . This study suggests that the deletion of rb1 gene can be used as one of the markers to guide ovarian cancer staging and prognosis of ovarian cancer .

【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31

【引證文獻】

相關(guān)會議論文 前1條

1 孫雪梅;;急性髓性白血病多步驟發(fā)病機理與分子靶向治療[A];第10屆全國實驗血液學會議論文摘要匯編[C];2005年

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本文編號：1489429