本文關(guān)鍵詞： miR-130b 膠質(zhì)細(xì)胞瘤 Hippo信號(hào) 腫瘤干細(xì)胞　出處：《新疆醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM,世界衛(wèi)生組織IV級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤)在成年人中它是最常見(jiàn)的惡性的原發(fā)性腦腫瘤,它是人類最致命的腫瘤之一。盡管在過(guò)去幾十年的治療中不斷取得進(jìn)展,但本病的治療及預(yù)后仍然很差,在美國(guó)和歐洲地區(qū)5年生存率平均小于3%。最近的研究已經(jīng)表明,在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,存在著膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(CSCs),膠質(zhì)瘤干細(xì)胞能自我分化并不斷的更新增殖成膠質(zhì)瘤細(xì)胞,并導(dǎo)致腫瘤不斷增殖生長(zhǎng)。本研究目的就是鑒于此理論基礎(chǔ),從惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤中分離表達(dá)CD133的細(xì)胞,通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)其是高度致瘤性,并且有很強(qiáng)的侵襲性和耐化療性。然而,對(duì)于維持膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分子機(jī)制在很大程度上仍然未知。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道,在維持腫瘤干細(xì)胞的干性上,發(fā)現(xiàn)miRNA起到一定的作用,miRNA是一類長(zhǎng)度為19~25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子,參與基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié),一般通過(guò)靶基因的3’端非翻譯區(qū)部分互補(bǔ)配對(duì)的結(jié)合方法來(lái)調(diào)控目的基因轉(zhuǎn)錄水平。研究表明,Hippo信號(hào)通路起著限制器官大小和抑制腫瘤發(fā)生起至關(guān)重要的作用。生物學(xué)上表明,Hippo信號(hào)通路在很大程度上限制了它的兩個(gè)下游效應(yīng)因子YAP和TAZ。而基因MST1-SAV1的活性直接影響到Y(jié)AP/TAZ的表達(dá)水平。在此,我們通過(guò)篩查出miR-130b在膠質(zhì)瘤中的高表達(dá)水平,通過(guò)過(guò)表達(dá)miR-130b后來(lái)檢測(cè)Hippo信號(hào)通路中的下游信號(hào)基因的表達(dá)及活性水平,同時(shí)檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志基因,包括CD133、SOX2、Nanog、MYC和BMI1表達(dá)水平,以觀察miR-130b對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的影響。這些研究為miR-130b在Hippo信號(hào)通路中的作用,以及miR-130b在膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)展中的作用提供了一種新的機(jī)制,而且為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供了一種很好的思路。方法:為了檢測(cè)miR-130b在膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中表達(dá)水平,我們收集膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本8例,正常組織3例。正常細(xì)胞NHA以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞SNB19、U87MG、LN444、LN18、U251MG。運(yùn)用BioTNT生物公司miR-130b檢測(cè)試劑盒(CL-has-miR-130b)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)我們檢測(cè)了miR-130b對(duì)膠質(zhì)瘤增殖及膠質(zhì)瘤干細(xì)胞成球的作用,將約500個(gè)細(xì)胞接種在6孔板上以及將約10個(gè)細(xì)胞接種在24孔板上,用無(wú)血清的培養(yǎng)基DMEM/F12培養(yǎng)13天,在培養(yǎng)的過(guò)種中加入2%B27,同時(shí)加入表皮生長(zhǎng)因子20ng/ml,和bFGF 20ng/ml,0.4%牛血清白蛋白(BSA)和為5μg/ml的胰島素。進(jìn)行培養(yǎng)后,然后檢測(cè)其成球的大小,算出其倍數(shù)。我們運(yùn)用WB方法檢測(cè)了miR-130b對(duì)Hippo信號(hào)通路中YAP、TAZ蛋白表達(dá)的影響,用核蛋白P84抗體作為參照(Sigma美國(guó)),同時(shí)檢測(cè)MST1和SAV1蛋白水平,用α-Tubulin抗體作為內(nèi)參對(duì)照(Sigma美國(guó))。用熒光素酶方法檢測(cè)mi R-130b對(duì)TEAD活性的影響,將購(gòu)買的TEAD質(zhì)粒在48孔板中共轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞,每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,操作按照LipofectamineTM2000試劑說(shuō)明書進(jìn)行,48h后進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)。運(yùn)用mi RBASE軟件預(yù)測(cè)miR-130b與MST1/SAV1的調(diào)控關(guān)系,軟件預(yù)測(cè)miR-130b與MST1/SAV1都存在調(diào)控位點(diǎn),運(yùn)用熒光素酶的方法,檢測(cè)miR-130b與基因MST1/SAV1是否存在調(diào)控作用,我們構(gòu)建了MST1/SAV13’端,同時(shí)設(shè)計(jì)突變位點(diǎn),共轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行上機(jī)檢測(cè),測(cè)定熒光值。結(jié)果:通過(guò)參考癌癥基因GBM miRNA芯片數(shù)據(jù)(TCGA),我們發(fā)現(xiàn)miR-130b水平明顯上調(diào)在人腦膠質(zhì)瘤組織(n=496)與正常腦組織相比(n=10)(P0.001)。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果。mi R-130b水平在8例GBM組織相比,與在3例正常腦組織中顯著增加,并與在5種膠質(zhì)細(xì)胞瘤的細(xì)胞系相比,在正常的人星形膠質(zhì)細(xì)胞(NHA)顯著降低。miR-130b對(duì)膠質(zhì)瘤增殖及膠質(zhì)瘤干細(xì)胞成球的作用,過(guò)表達(dá)miR-130b有力促進(jìn)懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生大約兩倍以上的細(xì)胞球。相反,mir-130b-抑制細(xì)胞形成的球體不及正常球體的2倍,我們的研究結(jié)果表明,miR-130b促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞瘤成球的作用。WB法檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平得知,過(guò)表達(dá)miR-130b使YAP、TAZ的表達(dá)增高,而抑制miR-130b的表達(dá)可以使蛋白YAP、TAZ的表達(dá)降低,而核因子P84的表達(dá)卻沒(méi)有影響,而過(guò)表達(dá)miR-130b后,MST1和SAV1蛋白水平降低,這說(shuō)明miR-130b直接影響了Hippo信號(hào)通路基因而發(fā)揮相關(guān)功能作用。熒光素酶進(jìn)一步驗(yàn)證了在過(guò)表達(dá)miR-130b的穩(wěn)定細(xì)胞株SNB19和LN18中,干擾YAP和TAZ的情況下,與陽(yáng)性對(duì)照的順鉑對(duì)比,檢測(cè)的熒光值為1、0.25、0.28和1、0.26、0.39,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。結(jié)論:YAP與TAZ均與TEAD有顯著的作用,其降低TEAD的活性比順鉑還要強(qiáng)。由mirBASE軟件預(yù)測(cè)miR-130b與MST1/SAV1有調(diào)控位點(diǎn),通過(guò)熒光素酶檢測(cè)提示mi R-130b與MST1/SAV1-3'UTR測(cè)得的熒光值顯著降低,說(shuō)明它們之間有結(jié)合點(diǎn),減弱了熒光的表達(dá),而在對(duì)照及正常組中,熒光的值沒(méi)有什么變化,在抑制組中,熒光值增強(qiáng),提示抑制劑阻止了與MST1/SAV1-3'UTR的結(jié)合,這些數(shù)據(jù)說(shuō)明miR-130b與MST1/SAV1-3'UTR存在結(jié)合的調(diào)控位點(diǎn),這與理論工具預(yù)測(cè)是一致的。所有的統(tǒng)計(jì)分析,進(jìn)行了用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件。兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用T進(jìn)行檢驗(yàn);P值0.05被認(rèn)為是差異有顯著意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：1488088