本文關鍵詞： 結直腸癌 MiR-19a THBS1 VEGF 轉(zhuǎn)移 機制　出處：《第三軍醫(yī)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：和絕大多數(shù)惡性實體腫瘤一樣,血道轉(zhuǎn)移和淋巴管轉(zhuǎn)移是結直腸癌主要的轉(zhuǎn)移途徑。在適合手術治療的結直腸癌患者中,有50%左右已經(jīng)發(fā)生了微血管或微淋巴管的轉(zhuǎn)移,這部分病人多數(shù)都會很快復發(fā),5年生存率只有10%左右。因此,癌細胞的轉(zhuǎn)移擴散是結直腸癌致死的主要原因。本課題檢測了miR-19a在結直腸癌組織和結腸癌細胞株中的表達情況,并在結腸癌細胞株中驗證miR-19a下調(diào)THBS1的基因表達對VEGF蛋白水平的影響及其對細胞增殖遷移能力的促進作用,進一步研究結直腸癌細胞的轉(zhuǎn)移規(guī)律,揭示其內(nèi)在機制。方法：本課題共分為四個部分。第一部分檢測結直腸癌組織及結腸癌細胞株中miR-19a的表達情況,包括以下實驗：①miR-19a在結直腸癌組織中的表達情況。收集臨床結、直腸癌標本,并根據(jù)是否伴有轉(zhuǎn)移情況分為兩組,即有轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組,用qRT-PCR的方法分別檢測癌組織中miR-19a的表達情況。②miR-19a在結腸癌細胞株中的表達情況。選取不同惡性程度的結腸癌細胞株LoVo,SW480和HT29,仍然用qRT-PCR方法分別檢測其miR-19a的表達情況。第二部分檢測結腸癌細胞株中THBS1和VEGF的表達情況。包括以下實驗：①qRT-PCR和Western-blot的方法分別檢測結腸癌細胞株中THBS1基因表達和蛋白表達的情況。②Western-blot檢測結腸癌細胞株中VEGF的表達情況。③免疫共沉淀的方法驗證結腸癌細胞株中THBS1蛋白與VEGF蛋白結合作用。第三部分驗證miR-19a對LoVo細胞THBS1表達的調(diào)控及其對LoVo細胞增殖和遷移能力的影響。①構建miR-19a的SiRNA質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染LoVo細胞。②驗證miR-19a表達抑制前后LoVo細胞增殖轉(zhuǎn)移能力的變化。第四部分通過雙熒光素酶實驗和雙熒光素酶突變實驗驗證miR-19a能夠與THBS1的3’端結合并抑制其表達。結果：①結直腸癌組織中miR-19a呈高表達,且有轉(zhuǎn)移組的表達明顯高于無轉(zhuǎn)移組；結腸癌細胞株中miR-19a表達程度由高到低依次是LoVo、SW480和HT29。②qRT-PCR實驗和Western-blot結果均顯示結腸癌細胞株中THBS1的表達以HT29最高,SW480次之,LoVo最低,差異顯著；Western-blot實驗檢測結腸癌細胞株中VEGF的蛋白表達情況結果以LoVo最高,HCT119和SW480次之,HT29最低,差異顯著；③結腸癌細胞株LOVO、SW480和HT29中THBS1與VEGF的免疫共沉淀均呈陽性反應。④成功構建miR-19a的SiRNA質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染LoVo細胞。劃痕試驗和Transwell實驗結果顯示轉(zhuǎn)染SiRNA質(zhì)粒后LoVo細胞增殖和遷移能力均顯著下降,THBS1的表達明顯升高；⑤雙熒光素酶實驗和雙熒光素酶突變實驗結果顯示miR-19a能夠與THBS1的3’端結合并抑制其表達,當miR-19a表達被抑制時,THBS1表達明顯升高。結論：①無論是結直腸癌組織中,還是結腸癌細胞株中,miR-19a均呈高表達,說明miR-19a與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展關系密切。②結腸癌細胞株中,miR-19a的表達程度LoVo最高,SW480次之,HT29最低,這與細胞株的惡性程度一致,說明它與結直腸癌細胞的惡性程度密切相關。③結腸癌細胞株中,THBS1的表達程度與細胞株的惡性程度相反,與miR-19a的表達程度亦相反；VEGF的蛋白表達程度與結腸癌細胞株的惡性程度一致,與miR-19a的表達程度也一致；在結腸癌細胞株中,THBS1蛋白和VEGF蛋白的免疫共沉淀反應均為陽性。這說明THBS1和VEGF能在結腸癌細胞株中發(fā)生結合反應,并且都與結直腸癌細胞的惡性程度密切相關。④報告基因?qū)嶒灲Y果顯示miR-19a通過與THBS1的3’端結合發(fā)揮表達抑制作用。⑤結腸癌細胞中,miR-19a通過下調(diào)THBS1基因表達使其蛋白生成減少,其與VEGF結合能力減弱,VEGF的蛋白水平升高,因而促微血管和淋巴管生成的作用增強,最終為結腸癌細胞通過新生微血管和淋巴管轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了便利條件。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.35

【參考文獻】

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