本文關(guān)鍵詞： 黃芪多糖 順鉑 增效減毒 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 細(xì)胞凋亡　出處：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：肺癌是目前發(fā)病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤,其中以非小細(xì)胞肺癌為多見(jiàn),約占肺癌所有病例的80%-85%。近二十年,肺癌的發(fā)病率每年以11%左右的速度遞增,以此預(yù)計(jì),我國(guó)肺癌的患者將在2025年達(dá)到世界“第一”。由于肺癌具有很強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移能力,所以是惡性度較高的腫瘤之一,且具有多種多樣的生物學(xué)特性,致使早期診斷困難,大多數(shù)就診時(shí)已是晚期,因此預(yù)后極差。在臨床上,早期的手術(shù)治療和晚期的化療始終是肺癌最主要的治療手段。順鉑(DDP)是多種惡性腫瘤的臨床常用鉑類化療藥物,能破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能,產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)。但由于不同個(gè)體對(duì)該藥物的敏感性不同,尤其是其對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用,包括抑制骨髓的造血系統(tǒng),腎臟毒性、神經(jīng)毒性、耳毒性、肝毒性以及多藥耐藥性(MDR)等特點(diǎn),限制了該類藥物的應(yīng)用。如果能在化療的同時(shí)配合中醫(yī)、中藥,進(jìn)行全身性的調(diào)理,則可以降低化療對(duì)機(jī)體的毒副作用,提高腫瘤患者的生活質(zhì)量。目前臨床常采用聯(lián)合用藥的方式,這樣即可降低化療藥物的給藥劑量,又能減輕化療藥物的各種毒副作用,延緩MDR的產(chǎn)生,并可增強(qiáng)抗腫瘤療效。近年研究證實(shí),許多中藥具有通過(guò)整體調(diào)節(jié)功能,增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的作用,以促使腫瘤細(xì)胞死亡或誘導(dǎo)凋亡,從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等過(guò)程。甘肅道地藥材黃芪是傳統(tǒng)的扶正固本中藥,歸肺經(jīng),是補(bǔ)氣藥之一。黃芪多糖(APS)是其最重要的天然有效活性成分,是含量最多、免疫活性最強(qiáng)的一類物質(zhì),具有調(diào)節(jié)免疫、補(bǔ)益肺氣、抗炎、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性、抗腫瘤等多方面作用。因此,本研究根據(jù)中醫(yī)扶正治療的原則,初步探討APS提高免疫功能、抗腫瘤、抗轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及對(duì)順鉑的增效減毒機(jī)制。本課題分體外(細(xì)胞)、體內(nèi)(動(dòng)物)實(shí)驗(yàn)兩部分進(jìn)行研究。(1)體外實(shí)驗(yàn)通過(guò)噻唑藍(lán)比色法(MTT)觀察了不同濃度的APS對(duì)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞(LLC)生長(zhǎng)的影響;激光共聚焦顯微鏡(LSCM)下檢測(cè)不同濃度的APS對(duì)LLC細(xì)胞骨架、線粒體膜電位(MMP)及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的動(dòng)態(tài)變化。(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分主要通過(guò)LLC荷瘤小鼠模型,以低、中、高劑量APS及與減半劑量的DDP聯(lián)合使用后對(duì)其進(jìn)行干預(yù),在計(jì)算抑瘤率的基礎(chǔ)上,計(jì)算荷瘤小鼠的瘤質(zhì)量、體質(zhì)量、有效體質(zhì)量等變化,并運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)、免疫組織化學(xué)(SP)、蛋白免疫印跡(WB)等方法研究其對(duì)瘤組織細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞因子及DDP所致免疫功能低下的影響;核因子-κB(NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)的影響;腫瘤組織Caspase-9、Bcl-2、Bax、Fas L等凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響;血清Ⅳ型膠原蛋白(Col4)和透明質(zhì)酸(HA)含量等表達(dá)的影響。1.MTT顯示:終濃度為50μg/ml~400μg/ml的APS各時(shí)間點(diǎn)均可不同程度的抑制小鼠LLC的增殖(P0.05),以APS 200μg/ml作用最顯著。2.LSCM顯示:(1)APS各劑量組中LLC的微管、微絲排列早期出現(xiàn)分布變化,晚期數(shù)量減少,斷裂、塌陷,熒光著色變淺(P0.05)。(2)APS各劑量組在24、48、72h的時(shí)間點(diǎn)上,均可以明顯降低小鼠LLC的MMP、升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(P0.05),兩者均在24 h內(nèi)變化最明顯,即早期作用顯著。這可能是其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制之一。3.中、高劑量APS及聯(lián)合用藥各組對(duì)Lewis肺癌小鼠均有顯著的抑瘤作用(P0.05),并可明顯改善Lewis肺癌小鼠的體質(zhì)量、有效體質(zhì)量、瘤質(zhì)量(P0.05),以聯(lián)合用藥組作用更為顯著。q值在0.85~1.15之間,提示APS與減半劑量的DDP聯(lián)合使用,療效具有相加效應(yīng)。4.APS及聯(lián)合用藥各組可提高Lewis肺癌小鼠血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平(P0.05);提高實(shí)驗(yàn)小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù),說(shuō)明APS能增強(qiáng)DDP所致免疫功能低下小鼠的免疫功能,對(duì)免疫器官有一定的保護(hù)作用。5.Q-PCR和WB顯示:(1)APS中、高劑量組肺癌移植瘤組織NF-κBp65、P53的表達(dá)明顯降低(P0.05或P0.01);但對(duì)p38MAPK基因和蛋白的表達(dá)影響不明顯。聯(lián)合用藥低、中劑量組降低NF-κBp65、P53及P38表達(dá)的作用弱于DDP組(P0.05或P0.01),但高劑量組作用與DDP組接近(P0.05)。(2)APS高劑量組及聯(lián)合用藥各組中,肺癌移植瘤組織Bcl-2、Fas L明顯下降,而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)明顯升高(P0.05);聯(lián)合用藥低、中劑量組,對(duì)Bcl-2/Bax、Fas L的影響不及DDP組(P0.05),而聯(lián)合用藥高劑量組與DDP組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。提示APS可能通過(guò)下調(diào)腫瘤組織中NF-κB、P53基因和蛋白的表達(dá),下調(diào)Bcl-2、Fas L等抗凋亡基因的表達(dá),上調(diào)Bax等促凋亡基因的表達(dá),使Bcl-2/Bax比例降低,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,這可能是APS發(fā)揮抑瘤、抗轉(zhuǎn)移作用的分子機(jī)制之一。6.SP提示:APS中、高劑量組肺癌移植瘤組織Caspases-9的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P0.05或P0.01);聯(lián)合用藥低、中劑量組的作用弱于DDP組(P0.05或P0.01),而高劑量組作用接近DDP組(P0.05)。提示APS可能通過(guò)提高移植瘤組織中Caspases-9的表達(dá),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。7.APS各劑量組及聯(lián)合用藥組均可降低小鼠血清中Col4和HA含量,聯(lián)合用藥組作用更明顯(P0.05或P0.01)。提示APS可能通過(guò)阻止肺癌移植瘤細(xì)胞與基質(zhì)的黏附、減少基底膜降解,從而抑制小鼠肺癌移植瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。8.上述作用在APS與減半劑量的DDP聯(lián)合使用時(shí),可增強(qiáng)DDP化療效果,從而降低DDP毒性,對(duì)DDP具有增效減毒作用。
[Abstract]:Astragalus polysaccharides ( APS ) is one of the most important therapeutic methods for lung cancer . The effects of APS on the growth of mouse Lewis lung cancer cells ( LLC ) were studied by MTT assay . ( 2 ) At 24 , 48 , and 72 hours , the levels of MMP - 2 , IL - 6 , IL - 12 , TNF - 偽 in Lewis lung cancer mice were significantly decreased in APS group , and the effect of APS on the expression of IL - 2 , IL - 6 , IL - 12 and TNF - 偽 in mice with Lewis lung cancer was significantly improved . ( 2 ) The expression of Bcl - 2 , Fas L and Bcl - 2 / Bax in tumor tissues were significantly higher than that in DDP group ( P0.05 or P0.01 ) .

【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2
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本文編號(hào)：1470781